[發(fā)明專利]一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611245066.2
• 申請(qǐng)日: 2016-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN108265111B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王卉;楊晉;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯桂麗

本發(fā)明提供了一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和應(yīng)用，具體涉及一種提高雙末端測(cè)序質(zhì)量的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和提高雙末端測(cè)序質(zhì)量的方法，所述反應(yīng)體系包括1×Phi29 buffer、dNTP、Phi29聚合酶和PCR增強(qiáng)劑。本發(fā)明在生成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)體系中添加組合的PCR增強(qiáng)劑，通過甘油、DMSO、Triton X?100、海藻糖和甜菜堿之間相互促進(jìn)，發(fā)揮了協(xié)同增效的作用，能明顯提高互補(bǔ)鏈合成的效率，提高測(cè)序的準(zhǔn)確度，測(cè)序的平均信號(hào)值提高了1.1倍；同時(shí)采用CTAB處理生成的互補(bǔ)鏈，限制了Phi29酶的外切活性，顯著降低了LagRunon值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和應(yīng)用，具體地，涉及一種提高雙末端測(cè)序質(zhì)量的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和提高雙末端測(cè)序質(zhì)量的方法。

背景技術(shù)

多重置換擴(kuò)增(MDA)是目前公認(rèn)的最好的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，它能對(duì)全基因組進(jìn)行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增出10～100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。MDA技術(shù)廣泛用于全基因組擴(kuò)增，是目前對(duì)整個(gè)基因組覆蓋最廣，各位點(diǎn)擴(kuò)增偏倚最小的全基因組擴(kuò)增方法。目前，此方法也被用于高通量測(cè)序領(lǐng)域。

DNA納米球(DNAnanoball,DNB)技術(shù)是將基因組DNA首先經(jīng)過片段化處理，再加上接頭序列，并環(huán)化形成單鏈環(huán)狀DNA，隨后使用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling circleamplification,RCA)將單鏈環(huán)狀DNA擴(kuò)增2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物稱為DNB，最終納米球經(jīng)過DNB裝載技術(shù)固定在陣列化的硅芯片上。

Rongqin Ke,et.al.,Patent.,US 20160237488 A1公開了基于MDA原理進(jìn)行DNB互補(bǔ)鏈生成來實(shí)現(xiàn)對(duì)DNB雙末端的測(cè)序的方法，DNB在進(jìn)行雙末端測(cè)序中，測(cè)完一條鏈后，首先需要長出一條互補(bǔ)鏈，再對(duì)其互補(bǔ)鏈進(jìn)行測(cè)序，因此互補(bǔ)鏈長得好壞對(duì)測(cè)序質(zhì)量的影響很大。現(xiàn)有的方法是使用常規(guī)的MDA方法進(jìn)行互補(bǔ)鏈生成，然后進(jìn)行測(cè)序，這種方法會(huì)導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)較低，測(cè)序質(zhì)量較差。

目前的DNB互補(bǔ)鏈生成方法有兩方面不足：(1)互補(bǔ)鏈測(cè)序信號(hào)較低；(2)互補(bǔ)鏈測(cè)序指標(biāo)LagRunon(Lag指測(cè)序時(shí)堿基合成滯后，Runon指測(cè)序時(shí)堿基合成超前)明顯較高，影響測(cè)序質(zhì)量，如何提供互補(bǔ)鏈的測(cè)序信號(hào)，如何降低測(cè)序指標(biāo)LagRunon成為一個(gè)亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和應(yīng)用，具體涉及一種提高雙末端測(cè)序質(zhì)量的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和提高雙末端測(cè)序質(zhì)量的方法，本發(fā)明采用不同組合的PCR增強(qiáng)劑及CTAB處理生成的互補(bǔ)鏈，提高了測(cè)序的質(zhì)量。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括1×Phi29 buffer、dNTP、Phi29聚合酶和PCR增強(qiáng)劑。

本發(fā)明中，所述dNTP和Phi29聚合酶為現(xiàn)有技術(shù)中MDA技術(shù)中的常規(guī)組分，所述dNTP和Phi29聚合酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)濃度都是可行的，在本發(fā)明中，所述dNTP的摩爾濃度為500mM，所述Phi29聚合酶的濃度為10U。

根據(jù)發(fā)明，所述PCR增強(qiáng)劑為甘油、DMSO、Triton X-100、海藻糖或甜菜堿中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為甘油、DMSO、Triton X-100和海藻糖的組合，或甘油、DMSO、Triton X-100和甜菜堿的組合，或甘油、DMSO、Triton X-100、海藻糖和甜菜堿的組合，進(jìn)一步優(yōu)選為甘油、DMSO、Triton X-100和海藻糖的組合，或甘油、DMSO、Triton X-100和甜菜堿的組合。