[發(fā)明專利]一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系、其組成的試劑盒和應(yīng)用有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201611245066.2 | 申請(qǐng)日： | 2016-12-29 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN108265111B | 公開（公告）日： | 2022-01-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王卉;楊晉;陳奧;徐崇鈞;章文蔚 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 深圳華大智造科技股份有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/6869 | 分類號(hào)： | C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京品源專利代理有限公司 11332 | 代理人： | 鞏克棟;侯桂麗 |
| 地址： | 518083 廣東省深圳*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 末端 反應(yīng) 體系 組成 試劑盒 應(yīng)用 | ||
1.一種用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系包括1×Phi29buffer、dNTP、Phi29聚合酶和PCR增強(qiáng)劑；
所述PCR增強(qiáng)劑為甘油、DMSO、Triton X-100和海藻糖的組合，或甘油、DMSO、Triton X-100和甜菜堿的組合；
所述甘油按體積分?jǐn)?shù)計(jì)占所述反應(yīng)體系的30％；
所述DMSO按體積分?jǐn)?shù)計(jì)占所述反應(yīng)體系的7％；
所述Triton X-100按體積分?jǐn)?shù)計(jì)占所述反應(yīng)體系的0.8％；
所述甜菜堿的摩爾濃度為0.1-0.6M；
所述海藻糖的摩爾濃度為0.02-0.2M；
所述反應(yīng)體系還包括CTAB；
所述CTAB的摩爾濃度為1-5mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系，其特征在于，
所述甜菜堿的摩爾濃度為0.2-0.6M；
所述海藻糖的摩爾濃度為0.08-0.2M。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于雙末端測(cè)序的反應(yīng)體系，其特征在于，
所述甜菜堿的摩爾濃度為0.5M；
所述海藻糖的摩爾濃度為0.1M；
所述CTAB的摩爾濃度為1mM。
4.一種用于雙末端測(cè)序的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系。
5.一種在雙末端測(cè)序中生成互補(bǔ)鏈的方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)將DNA納米球裝載到芯片上，使用包含測(cè)序引物的試劑進(jìn)行DNA納米球5’端測(cè)序；
(2)5’端測(cè)序完成后，使用切除試劑切除最后一個(gè)堿基所帶的熒光和阻斷基團(tuán)，使用洗脫試劑進(jìn)行洗滌；
(3)加入如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系，生成互補(bǔ)鏈。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
步驟(3)所述生成互補(bǔ)鏈具體包括以下步驟：
將所述反應(yīng)體系混合均勻后加入芯片表面，在35-37℃下進(jìn)行互補(bǔ)鏈生成，生成時(shí)間為30-40min；
所述反應(yīng)體系包括：1×Phi29 buffer、摩爾濃度500mM dNTP、10U Phi29聚合酶、體積分?jǐn)?shù)30％的甘油、體積分?jǐn)?shù)7％的DMSO、體積分?jǐn)?shù)0.8％的Triton X-100和摩爾濃度0.1-0.6M的甜菜堿，或1×Phi29 buffer、摩爾濃度500mM dNTP、10U Phi29聚合酶、體積分?jǐn)?shù)30％的甘油、體積分?jǐn)?shù)7％的DMSO、體積分?jǐn)?shù)0.8％的Triton X-100和摩爾濃度0.02-0.2M的海藻糖。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，
所述甜菜堿的摩爾濃度為0.2-0.6M；
所述海藻糖的摩爾濃度為0.04-0.15M。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，
所述甜菜堿的摩爾濃度為0.5M；
所述海藻糖的摩爾濃度為0.1M。
9.一種雙末端測(cè)序的方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)實(shí)施如權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的方法，生成互補(bǔ)鏈；
(2)加入阻斷試劑進(jìn)行末端阻斷；
(3)再加入包含互補(bǔ)鏈測(cè)序引物的試劑，進(jìn)行測(cè)序。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述包含互補(bǔ)鏈測(cè)序引物的試劑為包含互補(bǔ)鏈測(cè)序引物與CTAB的混合物；
所述互補(bǔ)鏈測(cè)序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述互補(bǔ)鏈測(cè)序引物的摩爾濃度為3-6μM；
所述CTAB的摩爾濃度為1-5mM。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，
所述互補(bǔ)鏈測(cè)序引物的摩爾濃度為4μM；
所述CTAB的摩爾濃度為1mM。
12.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系、如權(quán)利要求4所述的試劑盒、如權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的在雙末端測(cè)序中生成互補(bǔ)鏈的方法或如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的雙末端測(cè)序的方法在高通量測(cè)序中的應(yīng)用。
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