[發明專利]一種同序雙擴增的數字定量PCR方法

有效

• 申請號: 201611243465.5
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN106834441B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 江洪;曲越;曲超琪
• 申請（專利權）人: 澳門帝傑數碼基因有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6848
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 俞梁清

本發明公開了一種同序雙擴增的數字定量PCR方法，該方法是一種倍比稀釋樣本定量PCR方法，其特征是先用3’端縮短3?6b堿基的短靶引物預先擴增10?15個循環而預放大10²?10⁴倍，然后用中部同序的長靶引物PCR反應液于同管內稀釋預擴液10?20倍再熒光PCR 30?35循環，礦物油密閉下無熱蓋擴增，預擴短引物末端5?8b同序且與中部同序的長靶引物同源而不易引物間聚合，稀釋后35循環內無非特異性，以確保≥“1”分子有效檢測和“0”無擴增反應的數字dPCR方法。

技術領域

本發明屬于分子生物學及分子檢驗的核酸擴增PCR技術領域，具體涉及通過末端稍短同引物預擴增來提高靈敏度和部分同序引物限制其非特異性而進行稀釋定量的數字PCR領域。

背景技術

定量檢驗方法包括標準曲線定量法、內標定量方法和稀釋定量概念法。所謂稀釋定量是通過樣本倍比稀釋靶分子直至無靶分子反應再測稀釋倍數的定量數字化方法，或數字定量檢測或數字化診斷是指確保陽性單個分子或單個以上分子均有檢測信號而定為1、陰性絕對無反應信號而定為0的條件下，樣本稀釋、分散至大量的微型分隔單元使理論上每檢測單元含0-1個靶分子，通過檢測單元反應信號0-1計數和有限稀釋倍數而對靶分子進行定量的方法，以便于計算機0或1模式的自動化操作，但前提必須是檢測方法本身對1個分子或0分子可靠區分。然而傳統的化學反應、酶免疫反應等均是檢測信號強度與待測分子含量成線性比例且信號簡單相加的低靈敏度檢測方法，例如典型的靶分子A與加入試劑分子B形成產物C反應公式，有多少靶分子A就可以從耗去多少試劑B或產生多少分子C的信號相加來計量，但其靈敏度即最小檢出量往往大于納克水平(ng/ml)，如1納克水分子約為3×10¹³個分子數，可見低于檢測方法靈敏度范圍的靶分子測不出而容易假陰性反應，傳統低靈敏度方法遠遠區分不了1個靶分子和0分子的差別，所以無法適用于有限稀釋法的數字化定量檢測方法。

上世紀80年代誕生的核酸指數擴增的PCR技術，以其2ⁿ(n為擴增循環數)放大倍數能檢測低至數十乃至數個拷貝的靶分子，然而30個循環擴增的靈敏度仍不足以測出1個靶分子和0分子的區別，超過30個循環擴增又帶來嚴重的非特異性及假陽性；且這種第一代的終末/終點PCR因同樣量樣本經擴增超級放大后變化太大而終產量不均一，致使難以監測產物量來定量檢測。隨后兩輪擴增的巢式PCR應用(Porter-Jordan K.，et al.，1990，J.MedVirol30(2)：85-91)以超過總數40個循環擴增的極高靈敏度為單個靶分子檢測提供了可能，預擴外引物二聚體產物雖不會成為二輪擴增模板，但不同序的外側引物大大增加了系統引物間聚合非特異性，需要預擴后凝膠電泳純化來消除外引物非特異性；1992年，Sykes等人(Sykes P.J.，et al.，1992，BioTechniques 13：444-449)初步嘗試了基于樣本有限稀釋和泊松分布計數的定量巢式PCR，并首次提出了數字化定量理念，由于這類PCR系統內引物二聚體擴增和體系外氣霧膠交叉污染的嚴重非特異性而抵消了二次擴增放大作用。隨后，Higuchi另辟溪徑，同時擴增和“閉管”熒光檢測的實時熒光PCR方法，減少了PCR后處理的交叉污染，而通過擴增曲線指數期測定來對應初始模板數的相對定量，即進入指數期的擴增循環數與初始模板數呈反對數關系，但一般采用熒光染料的實時熒光PCR仍然于30個擴增循環處產生引物二聚體非特異性擴增，從而干擾低濃度的靶分子定量。1997年，不與非特異性擴增雜交的系列探針法實時熒光PCR(Wittwer C.，et al.，1997，BioTechniques22：130-138)顯著減少了非特異性反應，尤其以水解探針Taqman方法逐步成熟并廣泛應用于臨床檢驗，已被公認為第二代q-PCR定量PCR技術。但定量需要參考品標準曲線或內標校正，和有限的靈敏度仍不足以測出1個靶分子和0分子的區別而仍存在一定的數字定量應用限制。