[發明專利]一種同序雙擴增的數字定量PCR方法

有效

• 申請號: 201611243465.5
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN106834441B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 江洪;曲越;曲超琪
• 申請（專利權）人: 澳門帝傑數碼基因有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6848
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 俞梁清

1.一種同序雙擴增的數字定量PCR方法，其特征在于，為倍比稀釋樣本的雙擴增定量PCR，包括以下步驟：先用3’末端縮短3-6b堿基的短靶引物于小體積PCR反應液預擴增10-15個循環，接著用末端不縮短的中部同序靶引物PCR液于同管內稀釋預擴液10-20倍大體積熒光PCR 30-35個循環，礦物油密閉條件下無熱蓋擴增，總反應大于40個循環的同序雙擴PCR確保≥“1”分子有效檢出和無模板“0”無非特異性反應，根據樣本稀釋倍數、體積推算靶分子定量，所述方法為非疾病診斷，所述短靶引物為末端同序短靶引物。

2.根據權利要求1所述的同序雙擴增的數字定量PCR方法，其特征在于，是倍比稀釋樣本進行兩輪PCR雙擴增，首輪將靶引物3’末端縮短的14-18base短引物2-5μL PCR液預擴增12-14個熱循環來預放大1～2×10²-10⁴倍，再加入中部5-8b同序的17-24base長靶引物熒光PCR反應液稀釋預擴反應液10-20倍進行20-100μL第二輪熒光PCR 30-32個熱循環，礦物油密閉條件下無熱蓋擴增，確保單個靶分子及單個以上檢出為“1”；本底“0”無非特異反應；根據樣本稀釋至零靶分子的倍數、體積計算樣本靶含量的稀釋定量檢測數字PCR方法。

3.根據權利要求1所述的同序雙擴增的數字定量PCR方法，其特征在于，是一組樣本梯度稀釋的簡易數字定量PCR，樣本于EP管進行倍比梯度稀釋，取樣本×10⁰～×10^-5開始10×(倍)稀釋5次再2×(等比)稀釋5個梯度，確保有靶分子管稀至無靶分子管的轉折點落在梯度范圍內，PCR管先加0.5-1μL的5×預擴短引物PCR反應液和2-5μL稀釋樣本及30-50μL礦物油密閉，進行短引物45℃-50℃退火的12-14個熱循環第一輪PCR無熱蓋擴增；于第一輪同一管中加18μL-45/95μL的1×長引物PCR反應液，用加樣吸頭插入礦物油層下面加入，進行長靶引物54℃-60℃退火的30-35個熱循環第二輪PCR無熱蓋擴增。

4.根據權利要求1所述的同序雙擴增的數字定量PCR方法，其特征在于，是待測樣本進行9個或以上梯次的10倍連續稀釋后每個梯次的稀釋梯度又等量分配到有限個反應孔/反應單元，進行共96孔板、384孔板兩輪雙擴增PCR統計定量，采用樣本預先10倍稀釋的9組梯度重復PCR，總有一組10個PCR其靶分子理論數位于0-1之間，能取得相當于萬級甚至百萬級反應單元微流控或微滴化裝置的功效，以及在此基礎之上加一兩級的100倍稀釋或取舍；如在第二輪1×PCR反應液中加入1×SYBR Green I熒光染料可在第二輪進行熒光PCR檢測，或于第二輪PCR反應后每孔加入2-5μL的EB(0.5μg/mL)于礦物油層下面，置96孔板于紫外燈下顯色計數或于熒光光度儀檢測。

5.根據權利要求1所述的同序雙擴增的數字定量PCR方法，其特征在于，待測樣本進行9個梯次的10倍連續稀釋后每個梯次的稀釋梯度以縮小10倍體積等量分配至100-10000個反應單元聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR儀進行兩輪巢式PCR數字定量。

6.用于權利要求1-5中任一項所述的同序雙擴增的數字定量PCR方法的基因檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒成份包括：核酸提取試劑，dNTPs及dUTP，UDG酶，Taq，HKTaq酶及其緩沖液，預擴短引物F/R，長靶引物F/R，染料EB及SYBR Green I，純化水dH₂O，礦物油。