[發(fā)明專利]一種具有保肝護(hù)肝功能的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611240558.2
• 申請(qǐng)日: 2016-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN106632652A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張奇;趙兵;趙亮亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中馭（北京）生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/475
• 分類號(hào): C07K14/475;C12P21/06;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/16;C07K1/14
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有保肝護(hù)肝功能的低分子量豬胎肝促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素制備方法，屬于功能肽提取加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)

目前我國(guó)乙肝病毒攜帶者高達(dá)1.2億，慢性乙型肝炎患者約3000萬(wàn)例，其中10-20％可發(fā)展為肝硬化，1-5％可演變?yōu)楦伟Ｎ覈?guó)每年因肝癌死亡的人數(shù)約12萬(wàn)，肝炎導(dǎo)致的死亡高達(dá)50萬(wàn)。

肝硬化患者常伴有蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良，與患者的預(yù)后和肝移植術(shù)后并發(fā)癥密切相關(guān)，因此對(duì)肝硬化患者進(jìn)行精準(zhǔn)的營(yíng)養(yǎng)治療具有重要的臨床意義。臨床研究表明，哺乳動(dòng)物肝臟提取物可與其它藥物聯(lián)合治療重癥肝炎、攀發(fā)性肝炎，有效減輕患者肝臟損傷，促進(jìn)重癥病人血液中腫瘤壞死因子活性的增加。

促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(Hepatocyte Growth-promoting Factors，HGF)是從健康哺乳動(dòng)物的新鮮肝臟中提取的具有生物活性的多肽物質(zhì)。研究證明，HGF具有刺激DNA合成、肝細(xì)胞再生和保護(hù)肝臟等功能。作為提取物的主要活性物質(zhì)，用于各種肝病的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和聯(lián)合治療。HGF作為注射劑應(yīng)用于臨床，盡管其在不同物種之間具有高度的同源性，但也偶見過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)高分子量蛋白跨膜障礙較大，因此目前臨床使用的多為酶解的肽片段。目前報(bào)道的具備活性的HGF肽片段的分子量包括40kDa、20kDa、13kDa等說(shuō)法不一。經(jīng)過(guò)酶解后的低分子量HGF(HPN)片段具有免疫原性低、穩(wěn)定性高、存儲(chǔ)要求低、存儲(chǔ)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，且不易與其它蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，更適合作為肝病營(yíng)養(yǎng)的功能組件。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種具有保肝護(hù)肝功能的低分子量豬胎肝促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素制備方法，采用傳統(tǒng)的熱變性后酶解方法，結(jié)合色譜層析技術(shù)，從月齡乳豬新鮮肝臟中分離純化獲得高純度的分子量分別約為14kDa，8kDa，6kDa的HPN，在細(xì)胞水平上的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的活性表明，8kDa的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素小肽在1.5μg/mL和15μg/mL下，可有效促進(jìn)HpG2肝癌細(xì)胞的增殖，當(dāng)濃度達(dá)到150μg/mL時(shí)，可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

一種具有保肝護(hù)肝功能的低分子量豬胎肝促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素制備方法，將健康乳豬肝筋膜去除，剪碎至1-1.5cm³；以豬胎肝∶生理鹽水＝2∶3比例加入0.85％生理鹽水，充分破碎、勻漿；將勻漿液于95℃熱變性20～60min；高速離心后，收集上清液，測(cè)蛋白濃度，加入總蛋白1/40～1/60的胰蛋白酶，37℃水解0.5～2h，離心收集上清液；以10kD超濾膜過(guò)濾，收集超濾液，75％終濃度丙酮沉淀，去離子水復(fù)溶后Sephadex G-50凝膠柱分離純化，收集蛋白峰；真空冷凍干燥(3)，獲得低分子量豬胎肝促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素。

其中，胰蛋白酶最佳使用比例為1/50，最佳水解時(shí)間為1h，洗脫液采用去離子水。

經(jīng)分離純化，獲得3種低分子量豬胎肝促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，分子量分別約為14kDa，8kDa，6kDa，在細(xì)胞水平上的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的活性表明，8kDa的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素小肽活性最佳，對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)具有雙向調(diào)節(jié)功能，在1.5μg/mL和15μg/mL下，可有效促進(jìn)HpG2肝癌細(xì)胞的增殖，當(dāng)濃度達(dá)到150μg/mL時(shí)，可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本發(fā)明方案的實(shí)施，至少具有以下優(yōu)勢(shì)：

根據(jù)本發(fā)明方法，可有效分離獲得高活性的豬胎肝促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，與目前報(bào)道的分子量大小顯著不同；該小肽對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)具有雙向調(diào)節(jié)功能，低濃度時(shí)可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，高濃度是可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，具有保肝護(hù)肝功效。

附圖說(shuō)明

圖1是分離純化曲線；

圖2是促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素小肽細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，*代表具備顯著性差異。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，以使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚。以下實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

實(shí)施例1