[發明專利]一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測及預警方法

有效

• 申請號: 201611237638.2
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN106755579B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 王爽;張振臣;田雨婷;喬奇;秦艷紅;王永江;張德勝
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種檢測甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述的多重PCR引物包括引物對CP-F和CP-R、引物對VF和VR；其中，各引物對的序列如下：

CP-F：5’— ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’

CP-R：5’— GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’

VF：5’— GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’

VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。

2.一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取甘薯塊根的總RNA和總DNA；

（2）以甘薯塊根總RNA為模板進行反轉錄，得到反轉錄產物cDNA；

（3）以反轉錄產物cDNA和甘薯塊根總DNA為模板，利用多重PCR引物，進行PCR擴增；

（4）對PCR擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據檢測結果進行判定；

所述的多重PCR引物包括引物對CP-F和CP-R、引物對VF和VR；其中，各引物對的序列如下：

CP-F：5’— ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’

CP-R：5’— GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’

VF：5’— GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’

VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。

3.根據權利要求2所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟（2）中反轉錄的反應體系為10μL：10mM each dNTP 混合物1μL、5×反轉錄Buffer 2μL、200U/μL反轉錄酶0.5μL、40 U/μL RNase抑制劑0.25μL、10μmol/μL引物CP-R 0.5μL、200ng/μL總RNA 5.75μL；

反應程序為：42℃反轉錄40min，99℃ 5min，5℃ 5min。

4.根據權利要求2所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟（3）中PCR擴增的反應體系為20μL：Premix Ex Taq^TM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μL引物 CP-R各為0.5μL、10μmol/μL引物VF 和10μmol/μL 引物VR各為1μL、cDNA 0.5μL、200ng/μL DNA 1μL，ddH₂O補足20μL；

反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，57.6℃退火40s，72 ℃延伸50s，35個循環；最后72℃延伸10min。

5.根據權利要求2-4任一項所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法，其特征在于，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳判定結果為：當出現774bp大小的電泳條帶時，說明甘薯塊根攜帶甘薯褪綠矮化病毒；當出現194bp大小的電泳條帶時，說明甘薯塊根攜帶甘薯雙生病毒；當同時出現774bp和194bp兩個條帶時說明甘薯塊根攜帶甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒兩類病毒。

6.一種利用權利要求5所述的多重PCR檢測方法的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的預警方法，其特征在于，當電泳結果出現774bp和194bp任何一個條帶或同時出現兩個條帶時，說明甘薯塊根攜帶病毒，可判斷為不合格脫毒種薯，不能用于生產育苗。