本發(fā)明公開(kāi)了一種絲素?zé)晒馓结樀闹苽浞椒āＳ媒z素材料對(duì)噬菌體庫(kù)進(jìn)行篩選，得到與絲素蛋白特異性結(jié)合的噬菌體，進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序獲得的基因?qū)?yīng)的氨基酸序列作為絲素親和肽一級(jí)序列，通過(guò)多肽合成技術(shù)對(duì)絲素親和肽一級(jí)序列進(jìn)行多肽合成，得到絲素親和肽粉，將絲素親和肽粉和熒光素結(jié)合，得到絲素?zé)晒馓结槨１景l(fā)明所篩選的噬菌體對(duì)絲素材料具有很高的親和性，探針靈敏度高，檢測(cè)速度快，應(yīng)用前景廣泛，為絲素蛋白及絲素材料的高效靶向、鑒定提供更多的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種絲素?zé)晒馓结樀闹苽浞椒ǎ瑢儆谏锛夹g(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

生物大分子如蛋白質(zhì)和多肽，具有生物相容性、功能性和多樣性，是自然界生物的重要組成部分，也是人類用于改造自然，提高生活質(zhì)量的必要的原料。因此，對(duì)材料中蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析具有及其重要的作用，常要用具有高度靈敏度的生物學(xué)方法。對(duì)蛋白質(zhì)含量鑒定和定量的傳統(tǒng)方法有雙縮脲法、酚試劑法法及紫外吸收法等，但這些傳統(tǒng)的方法存在靈敏度低、非特異性測(cè)定的缺點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，質(zhì)譜特別是飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)已成為鑒定光譜性蛋白質(zhì)的重要技術(shù)。MALDI-TOF對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)主要有2個(gè)步驟：離子反射器和延遲提取，從而達(dá)到對(duì)樣本中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。這一技術(shù)能夠完成對(duì)極低含量的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，提高了蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度。

絲素蛋白是一種天然的高分子，由于其獨(dú)特的力學(xué)性能和良好的生物相容性、降解性和穩(wěn)定性，易于加工與修飾，以及本質(zhì)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，成為制藥、化工、食品添加劑和組織工程等領(lǐng)域中引人注目的一類生物材料。由于絲素蛋白具有生物降解性、生物相容性、生物可降解性和可加工性等優(yōu)良性能，可制備成多種形態(tài)的材料，如多孔狀、膜狀、纖維狀和管狀等，在科學(xué)研究中受到廣泛的關(guān)注和研究。絲素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸等18種氨基酸組成。雖然上述方法或技術(shù)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，但仍然不能對(duì)絲素蛋白進(jìn)行特異性鑒定，尤其是在含有其它蛋白質(zhì)的干擾下，不能夠?qū)z素蛋白進(jìn)行定性及定量。

絲素分子量最高可達(dá)350KDa，低分子量的絲素蛋白也有20kDa，且在這一區(qū)間存在很大的一個(gè)分子量跨度，因此絲素蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和多級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜；尤其當(dāng)絲素蛋白與其它蛋白混合后，普通方法難以對(duì)絲素進(jìn)行定性和定量。因此開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)絲素蛋白進(jìn)行特異性鑒別的探針具有很大的挑戰(zhàn)性。綜上所述，至今為止還沒(méi)有出現(xiàn)一種高效、簡(jiǎn)單的方法對(duì)絲素蛋白或絲素材料進(jìn)行特異性鑒別和定量。

發(fā)明內(nèi)容

熒光探針技術(shù)是影像技術(shù)中重要研究?jī)?nèi)容,通過(guò)靜電應(yīng)力、化學(xué)反應(yīng)、氫鍵作用等方法將擬檢測(cè)的對(duì)象(如生物分子、組織、材料等)在特定波長(zhǎng)激發(fā)下產(chǎn)生熒光并被肉眼或者儀器檢測(cè)的過(guò)程。

針對(duì)傳統(tǒng)制備技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提出了一種絲素?zé)晒馓结樀闹苽浞椒ǎ允删w篩選得到的絲素親和肽為中心，通過(guò)與熒光素接枝，得到特異性檢測(cè)絲素材料的熒光探針，該方法簡(jiǎn)單一步合成。

本發(fā)明的技術(shù)方案是采用如下步驟：

1)用絲素材料對(duì)噬菌體庫(kù)進(jìn)行篩選，得到與絲素蛋白特異性結(jié)合的噬菌體；

2)對(duì)步驟2)獲得的與絲素蛋白特異性結(jié)合的噬菌體進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序獲得的基因?qū)?yīng)的氨基酸序列作為絲素親和肽一級(jí)序列；

3)通過(guò)多肽合成技術(shù)對(duì)步驟(2)得到的絲素親和肽一級(jí)序列進(jìn)行多肽合成，得到絲素親和肽粉；

4)將步驟(3)得到的絲素親和肽粉和熒光素結(jié)合，得到絲素?zé)晒馓结槨?/p>

本發(fā)明實(shí)施例中將步驟(4)得到的絲素?zé)晒馓结樳M(jìn)行鑒定與應(yīng)用，絲素?zé)晒馓结樐軌驅(qū)z素材料或者含有絲素蛋白的材料進(jìn)行特異性結(jié)合并被熒光顯微鏡檢測(cè)到。

所述步驟1)具體為：

a.封閉絲素材料：將絲素材料加入含有TBS和BSA的緩沖液，TBS和BSA各自的濃度為0.1-10mg/ml；