[發明專利]一種絲素熒光探針的制備方法

有效

• 申請號: 201611234585.9
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN107057683B
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 楊明英;帥亞俊;呂如茵
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07K1/04;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

1.一種絲素熒光探針的制備方法，其特征是采用如下步驟：

1)用絲素材料對噬菌體庫進行篩選，得到與絲素蛋白特異性結合的噬菌體；

2)對步驟1)獲得的與絲素蛋白特異性結合的噬菌體進行基因測序，將測序獲得的基因對應的氨基酸序列作為絲素親和肽一級序列；

3)通過多肽合成技術對步驟2)得到的絲素親和肽一級序列進行多肽合成，得到絲素親和肽粉；

4)將步驟3)得到的絲素親和肽粉和熒光染料結合，得到絲素熒光探針；

所述步驟1)具體為：

a.封閉絲素材料：將絲素材料加入含有TBS和BSA的緩沖液；

b.絲素材料對噬菌體庫的篩選：將噬菌體肽加入到絲素膜的緩沖液中，常溫搖床中以160rpm轉速下搖振0.5-8h；

c.洗滌：用洗滌液將絲素膜洗滌1-10遍；

d.洗脫：將洗滌液除去，加入洗脫液常溫孵育1-20分鐘，將與絲素材料特異性結合的噬菌體洗脫下來；

e.中和：加入中和液，使得洗脫后的噬菌體液與中和液混勻后呈中性；

f.噬菌體擴增：將中和后的噬菌體液轉入到ER2738菌中，在37℃溫度的搖床中以150-220rpm轉速搖振3-24h，得到噬菌體和ER2738菌混合液；

g.噬菌體純化：將噬菌體和ER2738菌混合液進行離心，再加入到PEG和NaCl的混合液中進行純化，得到親和絲素材料的噬菌體菌液；

i.上述步驟a～g過程為一次循環，將步驟a～g經過2-6次重復循環之后，得到與絲素材料特異性結合的噬菌體液；

所述步驟a中的絲素材料采用以下方式進行制備：先將蠶絲蛋白粉末溶于有機溶劑或者水中形成蠶絲蛋白溶液，將蠶絲蛋白溶液滴在聚乙烯板上風干，加酒精處理使蠶絲蛋白固化，得到不溶解于水的絲素膜。

2.如權利要求1所述的一種絲素熒光探針的制備方法，其特征在于：所述步驟1)中的步驟c的洗滌包括用TBST洗滌液、磷酸鹽緩沖液、模擬體液、生理鹽水、Tris-HCl緩沖液，洗滌次數為1-10遍；所述步驟1)中的洗脫包括用Gly-HCl洗脫液，酸性、堿性洗脫液；所述步驟1)中的中和液采用Tris-HCl中和液。

3.如權利要求1所述的一種絲素熒光探針的制備方法，其特征在于：所述熒光染料選自以下組中的一種或多種：異硫氰酸熒光素、羅丹明、藍色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、Alexa Fluor、Cy3、Cy5。

4.如權利要求1所述的一種絲素熒光探針的制備方法，其特征在于：所述的絲素親和肽粉和熒光染料結合是通過化學接枝法、化學共價交聯或者螯合作用的方式將兩者進行連接。

5.如權利要求1所述的一種絲素熒光探針的制備方法，其特征在于：制備得到的所述絲素熒光探針用于檢測和鑒定絲素材料或者含有絲素蛋白的材料。