[發明專利]一種PCR法檢測漢族人HDV病毒的方法

在審

• 申請號: 201611233460.4
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN107653342A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 龐劍會
• 申請（專利權）人: 成都百泰賽維生物科技有限公司;龐劍會
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司51214
• 代理人: 房云

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種PCR法檢測漢族人HDV病毒的方法。

背景技術

HDV病毒(丁型肝炎病毒)是一種缺陷的嗜肝單鏈RNA病毒，需要HBV病毒(乙型肝炎病毒)的輔助才能進行復制，因此HDV與HBV同時或重疊感染，HDV與HBV同時或重疊感染傳染性更強。

目前我國臨床上對HDV沒有足夠認識，對HDV的檢測僅限于科學研究。檢測方法主要為ELISA法、ISH法和PCR法。用ELISA法檢測HDV，存在HDAg抗體效價差，檢測特異性不夠高，漏檢率高，假陰性高的缺點。ISH法為檢測HDV病毒的金標準，特異好，準確率高，但采用ISH法，需要新鮮組織標本，給人造成的損傷較大，且檢測周期為2天，檢測時間長。PCR法檢測HDV特異好，靈敏度高，所需樣本量少，對人體無創。

德國耶拿分析儀器股份公司的HDV RNA檢測試劑盒即是采用PCR法檢測HDV。該試劑盒通過PCR法檢測HDV，但該技術需要采用Taqman法擴增，需用專門的儀器和耗材進行檢測，試劑盒中所用的探針攜帶熒光發光基團，需要避光操作，保存時間短，反復凍融后熒光易淬滅，檢測條件嚴苛，檢測成本高。且該試劑盒中的引物為非特異性隨機引物，其序列與人的基因模板有三個位點是重合的，會對檢測產生干擾，使結果有假陽性的可能；該引物序列針對的是印第安人或歐洲人，未在漢族人中驗證，對于漢族人適用性差。

根據核苷酸序列同源性分析，HDV共有3種亞型，I型分布最廣泛在北美、歐洲、非洲、東亞、西亞和南太平洋地區；II型只分布在東亞；III型只分布在南美。國外文獻報道的引物都是針對I型或者III型，因為HDV病毒高度變異，含有多個SNP位點或者突變位點，因此針對I型或者III型的引物對II性HDV病毒檢測無效或者效果弱。即使同為II型檢測引物，因為我國漢族II型HDV病毒與國外公布序列相比，核苷酸同源性僅為66.3％，也不適于漢族人口的HDV病毒檢測。

因此提供一種PCR法檢測漢族人HDV病毒的方法，特異性強、靈敏度高，結果準確，操作簡單方便，檢測成本低，對人體無創，適于漢族人，成為了本領域技術人員亟待解決的技術問題。

發明內容

本發明提供了一種PCR法檢測漢族人HDV病毒的方法，該方法特異性強、靈敏度高，結果準確，操作簡單方便，檢測成本低，對人體無創，適于漢族人。

本發明采用的技術方案如下：

本發明的一種PCR法檢測漢族人HDV病毒的方法，包括以下步驟：

步驟1：合成引物，所述引物包括反轉錄引物和擴增引物組，所述反轉錄引物的核苷酸序列選自如SEQ ID NO:1所示的序列或如SEQ ID NO:2所示的序列；所述擴增引物組的核苷酸序列選自如SEQ ID NO:3所示的序列和SEQ ID NO:4所示的序列，或者如SEQ ID NO:5所示的序列和SEQ ID NO:6所示的序列；

步驟2：分離獲得RNA；

步驟3：配制反轉錄反應體系，進行反轉錄反應，獲得cDNA；

步驟4：配制PCR擴增反應體系，進行PCR擴增反應，PCR檢測。

優選地，所述反轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示的序列，所述擴增引物組的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的序列和SEQ ID NO:4所示的序列。

優選地，所述反轉錄引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示的序列，所述擴增引物組的核苷酸序列為SEQ ID NO:5所示的序列和SEQ ID NO:6所示的序列。

進一步優選地，所述步驟1合成的所述引物的濃度均為10pmol/μl。

更進一步優選地，所述步驟3中，所述配制反轉錄反應體系即將5μl所述步驟2得到RNA液加入到反轉錄反應體系中，所述反轉錄反應體系包括以下組分：

所述反轉錄反應的條件為25℃60min，65℃5min。

優選地，所述步驟4中，所述配制PCR擴增反應體系即將5μl所述步驟3得到cDNA液加入到擴增反應體系中，所述擴增反應體系包括以下組分：

所述擴增反應的條件為95℃2min；95℃30s，58.3℃30s，72℃10s，循環30次；2℃5min，4℃保存。

優選地，所述步驟4中，所述PCR檢測為1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。