[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)重組人白介素-12的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611232173.1
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN108251375B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭彬彬;盧世香;黃冰;姜會春;趙毅
• 申請（專利權(quán)）人: 康立泰藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/02
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)重組人白介素?12的方法，屬于生物制品生產(chǎn)工藝領(lǐng)域，其包括，1)利用無血清培養(yǎng)基將含有重組人白介素?12表達(dá)基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)復(fù)蘇活化，并放大培養(yǎng)獲得種子細(xì)胞；2)待種子細(xì)胞正常生長后，將種子細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性擴(kuò)大培養(yǎng)；3)將所得的種子細(xì)胞接種到生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)；4)培養(yǎng)過程中定期添加無血清補(bǔ)料培養(yǎng)基和谷氨酰胺，并監(jiān)測細(xì)胞生長情況；5)待細(xì)胞存活率低于80％時，結(jié)束培養(yǎng)收獲細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以高量的表達(dá)重組人白介素?12，且易于下游純化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品生產(chǎn)工藝領(lǐng)域，特別是一種利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)真核細(xì)胞中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)發(fā)酵生產(chǎn)重組人白介素-12的方法。

背景技術(shù)

白細(xì)胞介素-12(IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等發(fā)現(xiàn)，起初命名為NK細(xì)胞刺激因子(NKSF)和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子(CLMF)，1991年統(tǒng)一命名為白介素-12。

白細(xì)胞介素-12是一種70kDa的異二聚體，由兩條共價連接的亞基組成，一條為35kDa(P35亞基)，另一條為40kDa(P40亞基)。P35亞基由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和大單核細(xì)胞等，而P40鏈主要由激活的單核細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生，P35和P40單獨存在時均無任何生物活性。

IL-12具有調(diào)節(jié)和參與免疫應(yīng)答細(xì)胞的活性，刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-伽瑪(IFN-γ)，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，是連接固有免疫和獲得性免疫的核心因子。同時，IL-12可促進(jìn)造血功能的恢復(fù)，用于機(jī)體造血功能的降低導(dǎo)致的疾病。另外，IL-12還具有抗腫瘤，抗病毒的效果，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

在目前報道的利用真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生重組IL-12的方法中，重組IL-12的表達(dá)強(qiáng)度仍不令人滿意。

表1現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)條件和最高產(chǎn)量

從表1的參考文獻(xiàn)可以看出，重組人IL-12蛋白的生產(chǎn)方法中有的使用無血清培養(yǎng)基、有的使用含血清培養(yǎng)。前者較后者有很多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在培養(yǎng)基成分限定明確，能夠保證各批產(chǎn)品之間更高的產(chǎn)品質(zhì)量一致性，易于純化制備，能夠有效控制外源因子的污染。

表1的專利中，雖然有的使用了無血清培養(yǎng)基，但是由于細(xì)胞株和培養(yǎng)條件的限制沒有實現(xiàn)rhIL-12的高表達(dá)。

我們在專利號ZL201210345021.8和ZL201310507082.4中公開了人白介素-12的基因序列和構(gòu)建的含人白介素-12基因的高效表達(dá)工程細(xì)胞株CHO。

本發(fā)明對白介素-12的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了探索，力求增加重組人白介素-12的產(chǎn)量并保證蛋白的純度和活性。

發(fā)明內(nèi)容：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)重組人白介素-12的方法，所述方法采用含有重組人白介素-12基因的CHO細(xì)胞，通過優(yōu)化無血清培養(yǎng)條件，克服現(xiàn)有的培養(yǎng)方法所致的重組人白介素-12表達(dá)量低的問題。所采取的技術(shù)方案如下：

一種發(fā)酵生產(chǎn)重組人白介素-12的方法，其包括，1)利用無血清培養(yǎng)基將含有重組人白介素-12表達(dá)基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)復(fù)蘇活化，并放大培養(yǎng)獲得種子細(xì)胞；2)待種子細(xì)胞正常生長后，將所述種子細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性擴(kuò)大培養(yǎng)；3)將所得的所述種子細(xì)胞接種到生物反應(yīng)器中進(jìn)行放大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速100-120rmp、pH為6.8-7.3、溶氧為30％-50％；4)培養(yǎng)過程中定期添加無血清補(bǔ)料培養(yǎng)基和谷氨酰胺，并監(jiān)測細(xì)胞生長情況；5)待所述細(xì)胞存活率低于80％時，結(jié)束培養(yǎng)收獲細(xì)胞。