[發明專利]一種發酵生產重組人白介素-12的方法

有效

• 申請號: 201611232173.1
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN108251375B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 鄭彬彬;盧世香;黃冰;姜會春;趙毅
• 申請（專利權）人: 康立泰藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/02
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

1.一種發酵生產重組人白介素-12的方法，其包括，1)利用無血清培養基將含有重組人白介素-12表達基因的中國倉鼠卵巢細胞復蘇活化，并放大培養獲得種子細胞；2)待種子細胞正常生長后，將所述種子細胞進行適應性擴大培養；3)將所得的所述種子細胞接種到生物反應器中進行培養，培養條件為：轉速110-120rmp、pH為6.8-7.3、溶氧為30％-50％；4)培養過程中定期添加無血清補料培養基和谷氨酰胺，并監測細胞生長情況；5)待所述細胞存活率低于80％時，結束培養收獲細胞；

步驟3）中所述pH為前期7.10±0.05、中后期6.85±0.10；

所述步驟4)中，監測的谷氨酰胺的量，控制其濃度為1.5-5.0mM，監測的葡萄糖的量，控制葡萄糖濃度不低于2g/L。

2.根據權利要求1所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，所述步驟3)的培養條件為：轉速120rmp。

3.根據權利要求2所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，所述溶氧為40％。

4.根據1-3任一權利要求所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，所述步驟1)中無血清培養基為CD OptiCHOTM培養基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，復蘇培養條件為：125mL搖瓶，轉速110-120rpm，溫度37℃，5％CO₂培養箱。

5.根據1-3任一權利要求所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，所述步驟2)中所述適應性擴大培養采用無血清培養基，所述無血清培養基為CD OptiCHOTM培養基。

6.根據1-3任一權利要求所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，所述步驟4)無血清補料培養基為CHO CD Efficient Feed B。

7.根據1-3任一權利要求所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，所述步驟4)中無血清補料培養基在培養的第2、4、6、8天進行補料，補加量為終末培養體積的10％。

8.根據權利要求1所述的發酵生產重組人白介素-12的方法，其具體步驟為：1)利用無血清培養基CD OptiCHOTM培養基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺，將低溫保存的含有重組人白介素-12表達基因的CHO細胞復蘇活化，并放大培養獲得種子細胞，復蘇培養條件為：125mL搖瓶，轉速110-120rpm，溫度37℃；2)待種子細胞正常生長后，利用無血清基礎培養基CD OptiCHOTM培養基+0.18％F68+8mM L-谷氨酰胺將所述種子細胞進行適應性擴大培養；3)將所得的所述種子細胞接種到生物反應器中進行培養，培養基為CD OptiCHOTM，培養條件為：轉速120±10rpm、pH為前期7.10±0.05、中后期6.85±0.10、溶氧40％；4)在培養的第2、4、6、8天分別補充10％的無血清補料培養基CHO CD Efficient Feed B，控制葡萄糖濃度不低于2g/L，添加谷氨酰胺，控制其濃度為1.5-5.0mM，控制代謝廢物乳酸濃度不高于3g/L，氨濃度不高于20mmol/L；5)待所述細胞存活率下降至80％時，結束培養收獲細胞。