[發(fā)明專利]智利江蘺原生質體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611230340.9
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106893690B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設計）人: 劉濤;金月梅
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 劉曄

本發(fā)明涉及一種智利江蘺原生質體的制備方法，屬于藻類細胞工程領域。所述制備方法包括組織酶液制備、智利江蘺組織酶解等步驟，所述組織酶液制備步驟為：將其用1?10倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提4?18h，然后將浸提液調pH值至7.0?8.0，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；將海參酶液、纖維素酶和海水混合后即得組織酶液。

技術領域

本發(fā)明涉及一種智利江蘺原生質體的制備方法，屬于藻類細胞工程領域。

背景技術

植物原生質體是指去除細胞壁被質膜所包圍的、具有生活力的細胞，其結構包括細胞膜、細胞質(包括各種細胞器、細胞骨架系統(tǒng)及胞基質)和細胞核等部分。原生質體技術是指在原生質體的分離培養(yǎng)基礎上進行的一系列技術操作，主要包括原生質體植株再生、原生質體融合和細胞雜交、轉基因等培育變異新類型的生物技術等。原生質體培養(yǎng)和植株再生技術具有使用范圍廣、可行性強等優(yōu)點，是植物生物工程的基礎。

植物原生質體制備包括材料的選擇和預處理，組織分解和原生質體初步游離以及原生質體的純化和活力檢測。選擇適宜的材料是成功分離原生質體的基礎；酶解或機械處理前對于材料的預處理可以提高破壁效率并減少原生質的損傷；合理的酶制劑的選擇以及濃度的調節(jié)、滲透壓調節(jié)劑的選擇都是提高原生質產量及活性的關鍵。雖然近年來對于原生質的培養(yǎng)技術取得了迅速的發(fā)展，但是還存在原生質體活力不高，培養(yǎng)周期長等問題。

智利江蘺(Gracilaria chilensis)具有生長快、耐高溫的特性，是南方潛在的養(yǎng)殖品種之一。目前，江蘺主要通過營養(yǎng)生殖的方式進行繁殖。苗種的繁育受溫度、海水鹽度等環(huán)境因子的影響極大，極具不穩(wěn)定性。原生質體具有全能性，在人工控制的條件下可大量快速繁殖，可以緩解苗種的繁育壓力。此外，江蘺的細胞壁中含有較厚的膠質物，無法直接進行細胞融合、細胞雜交等遺傳操作，利用現(xiàn)有技術中常規(guī)的的酶溶解手段獲得的原生質體往往活性較低，產量也不理想。

專利CN2016101618265公開了一種縊江蘺原生質體的制備方法，其通過采用鮑消化腺酶液對縊江蘺組織進行酶解，從而制備原生質體。但本發(fā)明發(fā)現(xiàn)源自鮑消化組織的酶液對智利江蘺組織的酶解效果不佳。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供智利江蘺原生質體的制備方法。同時，根據(jù)海藻體細胞發(fā)育的全能性，利用工具酶分解智利江蘺組織，游離出體細胞原生質體，也可為遺傳工程研究提供理想受體系統(tǒng)。

在一個實施方案中，所述制備方法包括組織酶液制備、智利江蘺組織酶解等步驟，所述組織酶液制備步驟為：將其用1-10倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提4-18h，然后將浸提液調pH值至7.0-8.0，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；將海參酶液、纖維素酶和海水混合后即得組織酶液。

在一個具體實施方案中，所述組織酶液制備步驟為：將其用2倍海參腸體積的海水0℃勻漿破碎；在4℃下浸提12h，然后將浸提液調pH值至7.6，冷凍離心5min，取上層清液即得海參酶液；將海參酶液、纖維素酶和海水混合后即得組織酶液。

在進一步地實施方案中，所述組織酶液的具體組成為2.4ml纖維素酶、0.5ml海參酶液和17.1ml消毒海水。

在另一個實施方案中，所述智利江蘺組織酶解步驟為取智利江蘺組織用解剖刀將藻體切碎，加入制備好的組織酶液進行酶解，然后用200目的篩絹進行過濾，去除未消化的細胞、細胞團和碎片，去上清液離心，800rpm離心10min，使單細胞原生質體下沉，細胞碎片留在上清液中，棄去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水進行沖洗離心2-3次，收集沉淀后懸浮至2ml，即得原生質體。

在一個實施方案中，所述酶解條件為添加組織酶液的藻體組織放入25℃的恒溫搖床上進行黑暗酶解5h。

附圖說明

圖1：原生質體的熒光檢測圖(×20倍)左：原生質體；右：熒光染色后的原生質體，顯示紅色