[發(fā)明專利]一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611225377.2
• 申請(qǐng)日: 2016-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106635987B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬宜冬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波楓林生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;A61K35/17;A61P39/06;A61P31/12;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 黃勇

本發(fā)明公開(kāi)了一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用，解決了傳統(tǒng)地方法擴(kuò)增的NK細(xì)胞表現(xiàn)出低擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞因子依賴性、細(xì)胞衰老等問(wèn)題，其技術(shù)方案要點(diǎn)是如下步驟：Step1.通過(guò)傳統(tǒng)的Ficoll?Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；Step2.將人工抗原遞呈細(xì)胞經(jīng)100Grays輻照處理后，液氮凍存；Step3.將PBMC與輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞按質(zhì)量比為1:2的比例在添加有50IU/mL白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基的T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)共培養(yǎng)，每2?3天更換新鮮培養(yǎng)基；Step4.每隔7天，計(jì)算T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的總細(xì)胞數(shù)目，添加等細(xì)胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞，得到了獲得大量高純度高質(zhì)量NK細(xì)胞的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)和免疫治療領(lǐng)域，特別涉及一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

自然殺傷細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，屬于人體免疫細(xì)胞的一種，是具有細(xì)胞溶解作用、能夠分泌免疫調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，醫(yī)學(xué)上稱之為“人體抗腫瘤和抗感染的第一道防線”。與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞無(wú)須預(yù)先接觸抗原即可殺傷靶細(xì)胞(包括細(xì)菌、病毒感染的宿主細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)，且其殺傷效應(yīng)無(wú)MHC限制性，這種特性使得NK細(xì)胞在抗腫瘤反應(yīng)和免疫監(jiān)視病變細(xì)胞、癌變細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著巨大的作用。大量臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NK細(xì)胞治療在骨肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等癌癥治療中，起到了非常積極的治療效果。

然而，如何在體外獲得大量高純度高質(zhì)量的NK細(xì)胞一直限制著NK細(xì)胞免疫治療在臨床上的廣泛應(yīng)用。在健康人的外周血中，NK細(xì)胞大約占外周血淋巴細(xì)胞的5％-10％。傳統(tǒng)地，通過(guò)磁珠去除外周血淋巴細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞，再用高劑量的細(xì)胞因子如高劑量的白介素2或飼養(yǎng)層細(xì)胞刺激NK細(xì)胞的方法所獲得的NK細(xì)胞表現(xiàn)出低擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞因子依賴性、細(xì)胞衰老等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能獲得大量高純度高質(zhì)量的NK細(xì)胞的方法，即利用人工抗原遞呈細(xì)胞（artifical Antigen Presenting Cell, aAPC）和細(xì)胞因子聯(lián)合刺激外周血單核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC），獲得大量高純度高質(zhì)量NK細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟：

Step1.通過(guò)傳統(tǒng)的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將人工抗原遞呈細(xì)胞經(jīng)輻照處理后，液氮凍存；

Step3.將PBMC與輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞按質(zhì)量比為1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基的T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)共培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基；

Step4.每隔7天，計(jì)算T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的總細(xì)胞數(shù)目，添加等細(xì)胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞。

通過(guò)采用上述技術(shù)方案，F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心法利用顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定的離心力下，在對(duì)應(yīng)梯度取得純度較高的PBMC；利用輻照后的人工抗原蛋白具有不同于普通抗原蛋白新性能；按比例添加后，人工抗原遞呈細(xì)胞與低劑量的白介素2協(xié)同作用，相較于僅使用高劑量的白介素2，能夠進(jìn)一步刺激PBMC，使NK細(xì)胞在體外得到擴(kuò)增，得到高純度高質(zhì)量的NK細(xì)胞，通過(guò)該種方法，可進(jìn)行相對(duì)大規(guī)模的NK細(xì)胞的制備，使NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用成為可能，每隔7天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激，使PBMC分化NK細(xì)胞的過(guò)程能夠得到源源不斷地刺激，使NK細(xì)胞具有較大的擴(kuò)增量，經(jīng)上述方法制得的擴(kuò)增后的NK細(xì)胞，具有高純度、高質(zhì)量的特點(diǎn)，延長(zhǎng)了NK細(xì)胞的壽命，使擴(kuò)增后的NK細(xì)胞相較于未擴(kuò)增前具有更好的活性功能。