[發明專利]一種體外高效擴增NK細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 201611225377.2
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106635987B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 馬宜冬
• 申請（專利權）人: 寧波楓林生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P39/06;A61P31/12;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 黃勇

1.一種體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

Step1.通過傳統的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將人工抗原遞呈細胞經輻照處理后，液氮凍存；

Step3.將PBMC與輻照處理后的人工抗原遞呈細胞按質量比為1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培養基的T75的細胞培養瓶內共培養，每2-3天更換新鮮培養基；

Step4.每隔7天，計算T75的細胞培養瓶內的總細胞數目，添加等細胞數目的輻照處理后的人工抗原遞呈細胞再次刺激，連續培養21天，得到擴增后的NK細胞；

其中，所述人工抗原遞呈細胞為K562-mb.IL21＋CD137L細胞株，所述K562-mb.IL21＋CD137L細胞株包括穩定表達細胞膜結合型的白介素21和CD137配體的K562細胞株，所述細胞膜結合型的白介素21和CD137配體通過T2A連接，所述K562-mb.IL21＋CD137L細胞株的細胞系內整合有慢病毒載體，所述慢病毒載體上裝載有可轉錄成上述氨基酸序列的基因序列，所述白介素2的劑量為40~70IU/mL，擴增后的NK細胞的端粒長度要比擴增之前的NK細胞的端粒長度長8~15倍。

2.根據權利要求1所述的一種體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述細胞膜結合型的白介素21為白介素21與跨膜蛋白或鉸鏈蛋白相連而成的融合蛋白，其結構由GM-CSFsignal peptide、白介素21、IgG4和CD4相連而形成。

3.根據權利要求1所述的一種體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述輻照處理的輻照強度為80~150Grays。

4.根據權利要求1所述的一種體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述細胞膜結合型的白介素21和CD137配體都表達在K562細胞株的細胞系的細胞膜上。

5.根據權利要求1所述的一種體外高效擴增NK細胞的方法，其特征在于，所述擴增后的NK細胞的平均擴增的倍數為10⁵~10⁷倍。