[發明專利]一種食用菌液體菌種細菌污染檢測方法

有效

• 申請號: 201611223693.6
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106636299B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 胡建;梅麗娟;張洋;李青
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

本發明提供一種食用菌液體菌種細菌污染檢測方法，包括：1)分別對各稀釋度的代表污染細菌稀釋菌懸液進行NB平板培養計數和熒光染色測定，代表污染細菌為食用菌液體菌種常見污染細菌菌株；根據各稀釋度菌懸液平板計數結果(Bq)及相應熒光染色測定結果(Fg)建立標準曲線；2)使用適合濾除食用菌菌絲的濾膜，過濾食用菌液體菌種培養液；隨后，離心濾液，棄去培養液，并利用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀物，再沉淀后，取無菌水對沉淀細菌細胞再懸浮，并進行梯度稀釋；3)對步驟2)中獲得的污染細菌系列梯度菌懸液進行染色并測定熒光值，并依據標準曲線計算食用菌液體菌種中污染細菌濃度。該方法可快速、精確測定食用菌液體菌種污染細菌數量。

技術領域

本發明涉及一種液體菌種質量檢測的方法，尤其涉及一種食用菌工廠化栽培過程中液體菌種的質量檢測方法，屬于微生物領域。

背景技術

我國食用菌工廠化產業經歷了20多年的發展歷程，栽培設施硬件和技術水平均有了巨大的進步與創新。菌種制備作為食用菌工廠化栽培過程的重要環節，逐漸由傳統的基于固體培養基料的二級、三級種生產工藝發展為具有純度高、活力強、周期短、成本低等優點的液體菌種生產工藝。液體菌種的應用大大縮短食用菌栽培周期，為食用菌工廠化高效標準化生產奠定了重要基礎，但液體菌種生產過程極易產生細菌污染，并且傳統固體菌種質量檢查方法很難用來對液體菌種進行質控。

目前文獻報道的有關食用菌液體菌種細菌污染的檢測方法，主要包括感觀判斷、顯微鏡觀察、酸堿度測定以及培養檢測等。通過顏色、氣味以及形態等指標的感觀判斷，雖然對于菌種發酵早期污染有較高準確度，但對始于發酵后期的污染易造成失誤，同時并非所有細菌污染均會形成明顯的感官特征，并且主觀性的感官判斷缺乏統一標準；顯微鏡觀察以及基于酸堿度變化的測定對液體菌種中的少量細菌污染檢測精度不夠，因此這些方法均可能形成誤判，從而可能造成生產上的嚴重損失。與上述檢測方法相比，培養方法可較為準確地判斷液體菌種污染狀況，但由于培養時間一般需要24小時至48小時，檢測時效性較差，可能延誤液體菌種最佳接種時間，降低液體菌種發酵設備的利用效率。因此建立快速、精確的細菌污染檢測技術，是液體菌種技術安全、高效應用的關鍵。

有關食用菌液體菌種質量檢測的專利技術申請只有1件(CN 105087750A，“食用菌液體菌種檢測器”)，是一種用于液體菌種濃度檢測的裝置。針對液體菌種細菌污染檢測的專利申請信息幾乎未見。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速、精確測定食用菌液體菌種污染細菌數量的檢測方法。其基本理念是：運用BAClight染色法對經過了特異性分離的食用菌液體菌種中的污染細菌進行熒光染色，通過建立細菌濃度與熒光定量指標的數學關系模型，快速、精確測定食用菌液體菌種污染細菌數量。

為了實現以上目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種食用菌液體菌種細菌污染檢測方法，包括如下步驟：

1)標準曲線制備：

分別對獲得的各稀釋度的代表污染細菌稀釋菌懸液進行NB平板培養計數和熒光染色測定，所述的代表污染細菌為食用菌液體菌種常見污染細菌污染細菌G^-和G⁺類污染細菌中分別至少一種，如：假單胞菌(G^-)和枯草芽孢桿菌(G⁺)；隨后根據各稀釋度菌懸液平板計數結果(Bq)及相應熒光染色測定結果(Fg)建立標準曲線，以明確每種代表污染細菌數量與熒光值之間線性關系范圍。

進一步地，所述的代表污染細菌可以是兩種或者多種代表污染細菌株；優選地，所述的標準曲線可以是所使用的代表污染細菌株標準曲線的擬合標準曲線。