[發明專利]一種食用菌液體菌種細菌污染檢測方法

有效

• 申請號: 201611223693.6
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106636299B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 胡建;梅麗娟;張洋;李青
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種食用菌液體菌種細菌污染檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）標準曲線制備：

分別對獲得的各稀釋度的代表污染細菌稀釋菌懸液進行NB平板培養計數和熒光染色測定，所述的代表污染細菌為食用菌液體菌種G^-和G⁺污染細菌中分別至少一種；隨后根據各稀釋度菌懸液平板計數結果（Bq）及相應熒光染色測定結果（Fg）建立標準曲線；其中，代表污染細菌G^-和G⁺分別為假單胞菌和枯草芽孢桿菌；

具體操作步驟如下：

1.1 以常見食用菌液體菌種污染細菌假單胞菌及枯草芽孢桿菌作為污染細菌代表菌株，分別接種于滅菌NB液體培養基中搖瓶培養，培養條件：28℃恒溫，搖床轉速：180r/min，培養24小時后培養液細菌濃度范圍為1.8-2.0；

1.2 分別取假單胞菌、芽孢桿菌培養液10mL至50mL無菌離心管中，10000r/min離心5min，棄上清；

1.3 用滅菌生理鹽水30mL充分洗滌菌體沉淀3次，每次均10000r/min離心5min，棄上清；

1.4 取10mL無菌水對沉淀細菌細胞進行再懸浮處理，利用渦旋儀使細菌沉淀在液體中分散均勻，并進行10倍梯度稀釋形成系列梯度菌懸液；分別取200μL各梯度稀釋菌液涂布于滅菌NB平板培養基，28℃恒溫培養24小時后計數，計算各梯度稀釋液中活菌濃度Bq；

1.5 分別對上述制備的假單胞菌、枯草芽孢桿菌梯度稀釋菌懸液進行熒光染色，染色劑分別用2.5mL滅菌去離子水溶解，實驗時等比例混合，具體方法：于1mL系列稀釋菌懸液分別加入25μL SYTO 9+PI，1:1混合，均勻混合，室溫避光染色 15min；

1.6 利用上海棱光F97Xp熒光分光光度計測定上述各稀釋度細菌染液熒光強度，儀器測定條件：激發波長470nm，發射波長510nm，激發、發射光譜帶寬均為5nm，測定綠光吸收波長峰值計為Fg；

1.7 依據各稀釋度菌懸液平板計數結果Bq及相應熒光染色測定結果Fg建立標準曲線，假單胞菌標準曲線為：Fg₁＝250.7lg(Bq₁)+249.2，R₂＝0.997，檢測范圍5.2×10⁰～5.2×10⁷cfu/mL；芽孢桿菌標準曲線：Fg₂＝248.5lg(Bq₂)+216.7，R²＝0.995，檢測范圍8.5×10⁰～8.5×10⁷cfu/mL；擬合標準曲線：Fg＝249.6lg(Bq)+232.9，R²＝0.996；

2）通過待測菌定量加入步驟1）所使用的典型污染菌，形成模擬細菌污染液體菌種，使用適合濾除食用菌菌絲的濾膜，過濾液體菌種培養液；隨后，離心濾液，棄去培養液，并利用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀物，再沉淀后，取定量無菌水對沉淀細菌細胞進行再懸浮處理，并進行梯度稀釋形成系列梯度菌懸液；對獲得的污染細菌系列梯度菌懸液進行染色并測定熒光值，并依據標準曲線計算食用菌液體菌種中污染細菌濃度，并與液體菌種中實際參入污染細菌濃度比對，獲得校正系數；其校正公式為：實際值＝測量值×校正系數；

3）液體菌種細菌數量計算：使用適合濾除食用菌菌絲的濾膜，過濾液體菌種培養液；隨后，離心濾液，棄去培養液，并利用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀物，再沉淀后，取定量無菌水對沉淀細菌細胞進行再懸浮處理，并進行梯度稀釋形成系列梯度菌懸液；對獲得的污染細菌系列梯度菌懸液進行染色并測定熒光值，并擬合標準曲線計算食用菌液體菌種中污染細菌濃度，根據校正公式計算食用菌液體菌種細菌實際值。

2.如權利要求1所述的一種食用菌液體菌種細菌污染檢測方法，其特征在于，步驟2）中，所述的適合過濾食用菌菌絲的濾膜為孔徑是5 μm尼龍網。