[發明專利]一種構建FFPE樣本DNA文庫的方法

在審

• 申請號: 201611222985.8
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN108251515A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 劉偉;王秀莉;董超;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權）人: 安諾優達基因科技（北京）有限公司;浙江安諾優達生物科技有限公司;安諾優達（義烏）醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種構建FFPE樣本DNA文庫的方法，總體而言，本發明對FFPE樣本DNA文庫的構建方法做了改進，對低質量FFPE樣本DNA進行末端修復，純化；3'端加A；加接頭，純化以及PCR擴增，純化。其中，加接頭反應結束后，使用0.9×磁珠進行純化。本發明通過對建庫步驟的優化，降低了DNA片段的損失，即使采用低質量FFPE樣本DNA構建文庫仍然能夠獲得足夠高通量測序使用的文庫產量，使對低質量FFPE樣本的研究成為可能。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種構建FFPE樣本DNA文庫的方法。

背景技術

福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixed and Paraffin-embedded，FFPE)處理方法能夠較長時間地保存組織或制備檢驗所需的組織標本，所以在臨床病理檢驗、腫瘤基因檢測和醫學科學研究過程中常被用到，是一個可靠的分子生物學研究的材料來源。在世界范圍內，大約有數十億份組織樣品保存在醫院或者組織樣品庫中。其中絕大多數是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理的樣品。FFPE樣本通常代表了珍貴且來源廣泛的生物醫學研究材料，數量巨大的歸檔FFPE樣本為回顧性研究、闡明疾病機制、發現治療靶標和指示預后等方面提供了寶貴的資源。

然而，FFPE樣本特殊的制作方法和保存過程都對樣本中的核酸造成多方面的影響。組織醫學樣本在離體后即開始發生降解，福爾馬林的固定使組織中的核酸與核酸或核酸與蛋白之間交聯，石蠟的滲入過程進一步加速核酸的降解，保存時間及環境對樣品中的核酸也有極大的影響，上述這些原因最終導致通過樣本獲得的核酸質量大幅下降。

隨著二代測序技術的發展，大大地提高了樣本測序速度，降低了測序成本，使得應用二代測序方法對FFPE樣本DNA進行測序成為可能。近年來，利用二代測序方法對FFPE樣本DNA進行測序的應用前景廣闊，越來越多地應用于二代測序的FFPE樣本DNA的建庫方法應運而生。常用的FFPE樣本建庫方法如Illumina公司的FFPE樣本建庫方法，其主要步驟為：(1)對打斷后的樣本進行末端修復，使用1.8×磁珠純化，得到平末端DNA片段；(2)對平末端DNA片段進行加A，使用1.8×磁珠純化，得到加A產物；(3)對加A產物進行加接頭，使用1.8×磁珠純化，得到加接頭產物；(4)對加接頭產物進行PCR，使用0.9×磁珠純化，得到文庫。

在降解嚴重的FFPE樣品中DNA通常完整性很差，存在很多的小片段，采用現有建庫方法獲得的文庫通常均一性差(DNA片段大小差異導致)，文庫產量低，不能達到后續研究的需求量。現有的建庫方法可用于對普通FFPE樣本進行建庫，對于降解嚴重的低質量FFPE樣本DNA建庫則無法獲得足夠后續研究的文庫產量。石蠟包埋的醫療樣本通常總量都很有限，每個樣本都因其不可替代性而十分珍貴，所以如何通過低質量的FFPE樣本獲得的DNA建立合格的文庫已成為測序研究領域亟待解決的問題。

發明內容

鑒于上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種構建FFPE樣本DNA文庫的方法，對FFPE樣本DNA進行末端修復、純化；加A，加接頭、純化以及PCR擴增，純化。其中，加接頭反應后結束后，使用0.9×磁珠純化。通過上述優化的方法，能夠使低質量FFPE樣本DNA獲得的足夠后續測序研究的文庫產量，保證文庫的產出。

即，本發明包括：

1.一種構建FFPE樣本DNA文庫的方法，其包括：

步驟A：提取FFPE樣本的DNA，得到樣本基因組DNA片段；

步驟B：將樣本基因組DNA片段進行末端修復，純化得到平末端DNA片段；

步驟C：將平末端DNA片段進行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；

步驟D：將加3'端加A的DNA片段進行加接頭，純化得到加接頭DNA片段；

步驟E：將加接頭的DNA片段進行PCR擴增，純化得到DNA片段文庫，