[發明專利]一種山羊CDK2基因敲除載體及其構建方法

在審

• 申請號: 201611222742.4
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106834347A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 惠文巧;陳勝;湯繼順;班謙
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/11;C12N15/113
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種山羊CDK2基因敲除載體及其構建方法。

背景技術

CDKs的驅動才能完成細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶-2(Cyclin-dependent kinases 2,CDK 2)是CDK的家族成員之一。CDK2的生物學功能主要是參與細胞周期調控，可分別由細胞周期蛋白E(cyclin E)和細胞周期蛋白A(cyclin A)在細胞周期的不同時段激活，從而促進一系列細胞周期相關基因的轉錄，啟動DNA復制和誘發有絲分裂的雙重作用。

CRISPR/Cas9系統是細菌在噬菌體長期的選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源DNA入侵的免疫機制之一。在菌體內，CRISPR簇在其前導區的調控下轉錄成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9參與下加工成成熟的crRNA，引導crRNA/tracrRNA/Cas9復合體識別結合外源DNA特定序列，剪切DNA雙鏈，從而沉默外源基因的表達。CRISPR/Cas9系統被開發成了一種新型的基因打靶系統。相對于較早的RNAi、ZFN和TALEN系統，這種新型打靶系統具有操作簡單、成本低、效率高、可同時沉默任意數量基因等優點。目前，該項技術已經應用于細菌、斑馬魚、小鼠、大鼠、家蠶以及哺乳動物和人類細胞系等，且都表現出較強的基因組編輯活性。Hu等(2014)應用該技術對山羊成纖維細胞中NUP155基因進行了敲除，發現23個單細胞克隆中有5個發生了NUP155基因突變。Wang等(2015)采用CRISPR/Cas9技術對山羊MSTN和FGF5基因進行了敲除。以上研究提示該技術可以成功用于山羊基因敲除。

目前采用ZFNs或TALENs進行基因敲除，對每個基因位點編輯都需要設計和組裝兩個核酸酶,構建技術難度較大、構建組裝時間較長。另外，傳統基因敲 除，主要是應用基因重組原理通過插入突變和靶向技術使目的基因功能喪失。

發明內容

本發明的目的在于提供一種山羊CDK2基因敲除載體及其構建方法，旨在解決目前采用ZFNs或TALENs進行基因敲除，對每個基因位點編輯都需要設計和組裝兩個核酸酶,因而構建技術難度較大、構建組裝時間較長；而且傳統基因敲除，主要是應用基因重組原理通過插入突變和靶向技術使目的基因功能喪失的問題。

本發明是這樣實現的，

一種山羊CDK2基因敲除載體，該山羊CDK2基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：

CDK2-gRNA-Lg1：TTCTCCCGTCAACTTGTTTTTGG；

CDK2-gRNA-Rg1：GGCGCTTAAAAAAATCCGCCTGG。

一種表達山羊CDK2基因敲除載體的sgRNA核苷酸的質粒PYSY-sgRNA，

該質粒PYSY-sgRNA為：

pYSY-CMV-Cas9n-U6-CDK2-gRNA-L2-SV40-Neo質粒和

pYSY-CMV-Cas9n-U6-CDK2-gRNA-R2-EF1a-eGFP質粒。

一種山羊CDK2基因敲除載體的構建方法，該山羊CDK2基因敲除載體的構建方法包括：

采用CRISPR/cas9系統，首先設計CDK2基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；

構建同時表達sgRNA和Cas9D10A的質粒PYSY-sgRNA，連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞；

最后對轉化子進行驗證。

該山羊CDK2基因敲除載體的構建方法具體包括：

引物退火：將1ul 100uM的F-Oligo、1ul的100uM R-Oligo、8ul YSY oligo 退火緩沖液混合于PCR管內，在PCR儀中以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃；

連接：0.5ul退火產物，1ul YSY線性化三合一CRISPR/Cas9n質粒，1ul T4連接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q；

轉化：室溫15min后用pfu≥10⁸的大腸桿菌DH5a感受態細胞進行轉化；

轉化子驗證：轉化涂板后挑取單克隆進行10ul體系菌液PCR驗證；

經PCR初步鑒定，符合預期片段大小后進行測序；

菌液37℃過夜培養，無內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，并采用微量紫外分光光度計測定質粒濃度。