[發(fā)明專利]一種山羊CDK2基因敲除載體及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611222742.4
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106834347A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 惠文巧;陳勝;湯繼順;班謙
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/11;C12N15/113
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種山羊CDK2基因敲除載體，其特征在于，該山羊CDK2基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。

2.一種表達權(quán)利要求1所述山羊CDK2基因敲除載體的sgRNA核苷酸的質(zhì)粒PYSY-sgRNA，其特征在于，

該質(zhì)粒PYSY-sgRNA為：

pYSY-CMV-Cas9n-U6-CDK2-gRNA-L2-SV40-Neo質(zhì)粒和

pYSY-CMV-Cas9n-U6-CDK2-gRNA-R2-EF1a-eGFP質(zhì)粒。

3.一種如權(quán)利要求1所述的山羊CDK2基因敲除載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該山羊CDK2基因敲除載體的構(gòu)建方法包括：

采用CRISPR/cas9系統(tǒng)，首先設(shè)計CDK2基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；

構(gòu)建同時表達sgRNA和Cas9D10A的質(zhì)粒PYSY-sgRNA，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞；

最后對轉(zhuǎn)化子進行驗證。

4.如權(quán)利要求3所述的山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該山羊CDK2基因敲除載體的構(gòu)建方法具體包括：

引物退火：將1ul 100uM的F-Oligo、1ul的100uM R-Oligo、8ul YSY oligo退火緩沖液混合于PCR管內(nèi)，在PCR儀中以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃；

連接：0.5ul退火產(chǎn)物，1ul YSY線性化三合一CRISPR/Cas9n質(zhì)粒，1ul T4連接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q；

轉(zhuǎn)化：室溫15min后用pfu≥10⁸的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化；

轉(zhuǎn)化子驗證：轉(zhuǎn)化涂板后挑取單克隆進行10ul體系菌液PCR驗證；

經(jīng)PCR初步鑒定，符合預(yù)期片段大小后進行測序；

菌液37℃過夜培養(yǎng)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，并采用微量紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度。

5.如權(quán)利要求4所述的山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化涂板后挑取單克隆進行10ul體系菌液PCR驗證，具體包括：挑取單克隆0.5ul菌液，0.5ul YSY驗證正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ul MilliQ；PCR反應(yīng)條件為：

1)：95℃預(yù)變性2mim；

2)：94℃變性30s；

3)：56℃退火30s；

4)：72℃延伸30s；步驟2)到步驟4)運行35個循環(huán)；

5)：72℃再延伸10min；

6)：4℃保存。