[發明專利]一種大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法和功能驗證

有效

• 申請號: 201611218485.7
• 申請日: 2016-12-26
• 公開（公告）號: CN107641624B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 張秀香;年海;唐平;孟醒;閔祖輝;宋瑞鳳
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/60;C12N9/88;C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

本發明公開了一種大豆耐低磷基因Gm100776332及其克隆方法和應用，屬于資源與環境技術領域。本發明通過差異蛋白質組學探索大豆基因組中糖酵解途徑的相關基因，在低磷條件處理下，運用qPCR技術測定華春5號和瓦窯黃豆的表達量進行測定。運用差異蛋白組學和q PCR技術最終篩選到了差異明顯的Gm100776332基因，克隆了大豆耐逆基因Gm100776332，并通過轉化擬南芥對其耐低磷的關鍵性指標?可溶性糖含量進行測定。

技術領域

本發明屬于資源與環境技術領域，具體涉及一種大豆耐低磷基因Gm100776332克隆方法和功能驗證。

背景技術

大豆起源于我國，是我國的第四大糧食作物之一，富含脂肪和蛋白質。作為傳統的糧、油、飼料作物，在農業生產中具有非常重要的地位。磷素是植物生長發育和新陳代謝所必需的營養元素，它以多種方式參與植物體內的各種生物化學過程。但，土壤中大部分磷很難被植物吸收、利用。華南地區多為酸性紅壤，pH值低，磷很容易被固定，有效磷更是嚴重缺乏，導致該地區大豆產量較低、經濟效益很難滿足人們的生產需求，從而使土壤缺磷成為華南大豆生產的最重要的限制因子之一。通過增施磷肥，可提高土壤中有效磷的含量，但由于磷肥在土壤中擴散速度慢，導致磷素利用率非常低，而且大量施用磷肥也會帶來水體和土壤污染。

隨著分子生物學和分子遺傳學的發展，植物耐逆方面的研究取得了長足的進展。在分子水平上逐步地揭示耐逆的本質成為研究者的目標，因此，利用蛋白質組學研究，解析與大豆耐低磷相關的分子機制，發掘耐低磷基因，以實現大豆對磷素的高效利用，這對改善南方的大豆產量具有重要的現實意義和應用前景。本研究在實驗室前期研究的基礎上，解析了大豆耐低磷基因Gm100776332的相關功能，挖掘到了耐低磷基因，對今后的大豆遺傳改良奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于利用蛋白質組學探索大豆耐低磷的相關基因，首先對實驗室現有的耐低磷和磷敏感型大豆品種進行低磷處理、篩選，最后確定華春5號為耐低磷大豆品種，瓦窯黃豆為磷敏感型大豆品種。最后運用iTRAQ技術和qPCR技術挖掘耐逆基因，最終將該基因轉化到擬南芥中，最終得到了耐低磷基因。

在低磷處理48h后，對華春5號和瓦窯黃豆分別提取蛋白進行iTRAQ分析和qPCR測定，發現在糖酵解途徑發生了較為明顯的差異。發現在該途徑中丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase，PDC)表達量發生了明顯的變化，進而也引起了本研究的關注。丙酮酸脫羧酶是一種以焦磷酸硫胺素為輔酶的羧基裂解酶，在植物中廣泛存在。作為發酵途徑中的關鍵酶，PDC催化糖酵解所產生的丙酮酸脫羧生成乙醛。PDC驅動發酵代謝通路，通過與PDC競爭代謝丙酮酸參與植物體內的能量代謝和物質代謝，響應缺氧、低溫、高鹽等多種生物與非生物脅迫。本研究通過對該基因的克隆、功能驗證，發現該基因對低磷環境具有一定的抵抗能力。最終確定了該基因Gm100776332在大豆的耐低磷途徑中起著一定的作用，提供一種大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法。本發明的另一目的在于提供上述克隆方法獲得的大豆耐低磷基因Gm100776332。

本發明的另一目的在于提供上述基因Gm100776332的應用；所述的應用為大豆耐低磷基因Gm100776332的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法：應用引物F：5-ggatccATGAACACTAACATCCTCGGCG-3；引物R：5-ggtaccTCACTGAGGATTGGGAGGACG-3進行反轉錄PCR，94℃3min預變性，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，32個循環后72℃再延伸10min；對大豆華春5號在無磷條件下處理48h中克隆了Gm100776332基因，長度為2303bp，包含277bp的5’非翻譯區，214bp的3’非翻譯區和1812bp的開放式閱讀框。

一種大豆耐低磷基因Gm100776332由上述克隆方法獲得，其核苷酸基因序列如下所示：