[發(fā)明專利]一種大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法和功能驗(yàn)證

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611218485.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107641624B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張秀香;年海;唐平;孟醒;閔祖輝;宋瑞鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/60;C12N9/88;C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 廣東廣信君達(dá)律師事務(wù)所 44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種大豆耐低磷基因Gm100776332在參與耐低磷途徑中的應(yīng)用，其特征在于：

所述的大豆耐低磷基因Gm100776332的核苷酸基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在參與耐低磷途徑中的應(yīng)用，其特征在于：通過(guò)采用轉(zhuǎn)基因擬南芥來(lái)實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1中大豆耐低磷基因Gm100776332調(diào)節(jié)的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在參與耐低磷途徑中的應(yīng)用，其特征在于具體包括以下步驟：

（1）大豆耐逆基因的發(fā)掘：

華春5號(hào)大豆種子表面消毒，將消毒過(guò)的種子種于石英砂中，發(fā)芽后待幼苗長(zhǎng)出真葉時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至含不同磷濃度1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；然后將植株轉(zhuǎn)至無(wú)磷的液體培養(yǎng)液中處理48 h時(shí)，取2 cm左右的大豆根尖；提取蛋白質(zhì)，通過(guò)iTRAQ檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析，以及利用qPCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證，qPCR與iTRAQ技術(shù)獲得相同的結(jié)果，均發(fā)現(xiàn)PDC在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量都發(fā)生明顯的變化，通過(guò)NCBI找到該基因，命名為Gm100776332；

（2）大豆Gm100776332基因的克隆：

取iTRAQ測(cè)定的同一批大豆根尖材料，然后用TRIzol提取法進(jìn)行RNA的提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆出了Gm100776332的CDS序列，CDS序列長(zhǎng)度為1812 bp；測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)，Gm100776332的序列和William 82參考序列一致，連接pZeroBack/Blunt vector載體進(jìn)行測(cè)序，鑒定正確后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌中；

（3）擬南芥為載體來(lái)實(shí)現(xiàn)大豆耐逆基因Gm100776332參與耐低磷調(diào)節(jié)試驗(yàn)：

首先進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，Gm100776332基因轉(zhuǎn)化擬南芥陽(yáng)性植株的篩選，轉(zhuǎn)擬南芥耐低磷的基因時(shí)間點(diǎn)qPCR驗(yàn)證；為了進(jìn)一步了解Gm100776332的功能，構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體對(duì)擬南芥進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化，得到的T0代種子經(jīng)含有20 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10天后把具有抗性的苗移入營(yíng)養(yǎng)土中；得到T1代后，取以上20株T1代植株葉片提取基因組總DNA，用質(zhì)粒DNA作陽(yáng)性對(duì)照，野生型植株DNA和水作陰性對(duì)照，擴(kuò)增潮霉素基因，初步證明目的基因Gm1007763321已整合在擬南芥的基因組中；同時(shí)進(jìn)行野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株可溶性糖含量的測(cè)定，轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達(dá)量較野生型有了明顯的提高，通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，推測(cè)該基因可能參與大豆耐低磷機(jī)制。