[發(fā)明專利]一種類鮑魚蛋白質(zhì)保健飲料的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611209997.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN106721726A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫治政;劉建文;姜軍強(qiáng);王菁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東明鑫集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): A23L2/02
• 分類號(hào): A23L2/02;A23L2/04;A23L2/52;A23L2/66;A23L2/72;A23L33/10;A23L33/105;A23L33/17;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
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1.一種類鮑魚蛋白質(zhì)保健飲料的制備方法，其特征在于：其經(jīng)過下列工藝步驟：

（1）、鮑魚細(xì)胞RNA的提取

（1.1）、勻漿處理

稱取100～200mg鮑魚組織在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理；

（1.2）、靜置

將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫條件下靜置3～5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；

（1.3）、離心去雜質(zhì)

將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于2～8℃條件下，10000g離心8～10min，收取上清液；

（1.4）、抽提

將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積10%～20%的氯仿，劇烈振蕩15～20s，室溫靜置2～3min；

（1.5）、離心

將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于2～8℃條件下，10000g離心10～15min；樣品分為三層：有機(jī)相、水相和中間層；

（1.6）、沉淀

將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1～2的比例加入異丙醇，室溫靜置8～10min，于2～8℃條件下，10000g離心8～10min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；

（1.7）、洗滌

向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，再于2～8℃條件下，6000～7500g離心3～5min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；

（1.8）、干燥

將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5～10min，然后加入25～200μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于55～60℃條件下靜置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；

（2）、反轉(zhuǎn)錄

將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTM^II和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得鮑魚細(xì)胞的cDNA；

（3）、構(gòu)建表達(dá)載體

將步驟（2）中得到的鮑魚細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機(jī)引物：引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時(shí)，向其中加入菌液體積10%～15%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株；

（4）、蛋白表達(dá)

挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8～12h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8～12h；將500ml菌液接種至50～80L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標(biāo)，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至終濃度為0.3～0.4mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心30～60s，用發(fā)酵液體積10%～20%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心30～60s，取上清液，即為鮑魚RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物；

（5）、凝膠過濾

將步驟（4）中的鮑魚RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物進(jìn)行凝膠過濾層析，收集蛋白質(zhì)溶液，獲得隨機(jī)原核表達(dá)產(chǎn)物，即為類鮑魚蛋白質(zhì)溶液；

（6）、中藥提取液的提取

按重量份稱取中藥原料羅漢果6～8份、山楂8～10份、荷葉4～6份、薄荷3～5份、葛根2～4份、大棗4～6份，并將羅漢果、山楂、大棗用組織搗碎機(jī)搗碎，荷葉、薄荷和葛根粉碎后過200目篩；破碎的中藥原料混合后加入其質(zhì)量50～80倍的純凈水，加熱蒸煮浸提30～60min；離心，取上清液，得中藥提取液；

（7）、調(diào)配

稱量步驟（5）中得到的類鮑魚蛋白質(zhì)溶液、步驟（6）中得到的中藥提取液和市售的檸檬酸、木糖醇、蜂蜜、維生素c維生素、蒸餾水混合均勻，調(diào)整pH至7.0～7.5，得調(diào)配液；其中，在該調(diào)配液中，所述的類鮑魚蛋白質(zhì)溶液的重量百分比為30～40%、中藥浸提液為20～30%、檸檬酸0.5～1%、木糖醇0.5～1%、蜂蜜0.2～0.5%、維生素c2～3%，余量為蒸餾水，各組分的重量百分比之和為100%；

（8）、殺菌

將步驟（7）中得到的調(diào)配液經(jīng)精濾膜精濾后，進(jìn)行高溫瞬時(shí)滅菌；

（9）、灌裝

將步驟（8）中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按預(yù)設(shè)重量進(jìn)行分瓶真空灌裝，封口，冷卻至常溫，即得類鮑魚蛋白質(zhì)保健飲料。