[發明專利]一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法

有效

• 申請號: 201611208506.7
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106755110B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 吳錦艷;張志東;尚佑軍;田宏;陳妍;王光祥;劉湘濤;王耀杰;張吉利
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

1.一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法，其特征在于包括合成山羊信號淋巴細胞激活分子slam/V引物序列，通過構建山羊slam/V慢病毒表達載體，獲得slam/V復制缺陷型慢病毒樣粒子，以獲得的slam/V復制缺陷型慢病毒樣粒子感染Vero靶標細胞，篩選穩定表達slam/V的Vero陽性細胞亞克隆，驗證陽性細胞亞克隆Vero/Slam/V表達的Slam/V的活性、遺傳穩定性及其對PPRV復制的增殖效果；

所述slam/V引物帶有與載體匹配的B位點同源臂，其序列為：

SEQ ID NO.1: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC

TTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2: GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGG

CATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG；

所述Slam/V表達載體的構建，包括Slam/V與pDONRTM221供體載體進行 B、P 位點重組，獲得入門載體pDONR/Slam/V，pDONR/Slam/V 與pLenti 6.2/V5- DEST? Gateway?Vector 表達載體進行 L、R 位點重組獲得表達克隆pDEST/ Slam/V；

所述篩選穩定表達slam/V的Vero陽性細胞亞克隆，是采用殺稻瘟菌素blasticidin進行抗性篩選，獲得穩定表達Slam/V的Vero陽性細胞亞克隆；所述Vero細胞對殺稻瘟菌素blasticidin的耐受濃度為3.5ug/ml。

2.根據權利要求1所述的一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法，其特征在于所述獲得Slam/V復制缺陷型慢病毒樣粒子，是將pDEST/Slam/V質粒與包裝混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同轉染人胚腎細胞株293-FT，收獲細胞上清，獲得具有感染性的Slam/V復制缺陷型慢病毒樣粒子。

3.如權利要求1所述的一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法，其特征在于所述敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的驗證，采用靶標基因擴增方法、間接免疫熒光方法、western-blot免疫印跡檢測方法及致細胞病變效應分別驗證slam/V基因組整合、轉錄，slam/V蛋白表達、反應活性以及PPRV在表達slam/V的陽性細胞亞克隆上的增殖效果。