[發明專利]一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法

有效

• 申請號: 201611208506.7
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106755110B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 吳錦艷;張志東;尚佑軍;田宏;陳妍;王光祥;劉湘濤;王耀杰;張吉利
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法，包含山羊淋巴細胞信號活化因子Slam/V引物序列，slam/V慢病毒表達載體構建，slam/V復制缺陷型慢病毒的獲得，slam/V慢病毒感染靶標細胞Vero，敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的篩選、驗證，增強小反芻獸疫病毒易感性的驗證等。本發明包括具有提高PPRV復制能力的陽性細胞亞克隆，該陽性細胞亞克隆具有良好的生物學特性以及遺傳穩定性，其穩定表達的Slam/V具有明顯增強PPRV復制的功效。

技術領域

本發明涉及生物學領域中敏感細胞亞克隆的制備技術，特別涉及一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法。

背景技術

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)由小反芻獸疫病毒(Peste despetits ruminants virus，PPRV)引起，以高熱(40℃以上)、結膜炎、眼、鼻黏液性或膿性分泌物、口腔潰瘍、咳嗽、惡臭的腹瀉為主要臨床特征，肺炎和出血性腸炎為主要病理變化的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病屬于副黏病毒科(Paramyxo-viridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的成員，同屬的還有牛瘟病毒(Rinderpestvirus,RPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper，PDV)、海豚瘟病毒(Dolphin distemper，DDV)和麻疹病毒(Measles Virus,MV)。病毒分離和鑒定是當前流行PPRV毒株生物學特性研究的基礎，但PPRV在Vero、BHK-21、PK-15等常用的細胞系上或不易適應，或不產生典型細胞病變(CPE)，或傳代幾次后病毒丟失，分離率較低，影響和限制了對PPRV野毒株的分離、生物學特性和致病機制的研究。因此，建立易于PPRV培養增殖的敏感細胞，對開展PPRV的深入研究和疫苗毒生產都具有重要的應用價值。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術難以分離到高滴度小反芻獸疫病毒的不足，構建靶向小反芻獸疫病毒特定細胞受體的慢病毒載體介導穩定整合的一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法。

為解決上述問題，本發明采用了下述技術方案：

一種用于增強PPRV復制的敏感細胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法，包括山羊信號淋巴細胞激活分子Slam/V引物序列，通過構建山羊Slam/V慢病毒表達載體，獲得Slam/V復制缺陷型慢病毒樣粒子，以獲得的Slam/V慢病毒樣粒子感染Vero靶標細胞，篩選穩定表達Slam/V的Vero陽性細胞亞克隆，驗證陽性細胞亞克隆Vero/Slam/V表達的Slam活性、遺傳穩定性及其對PPRV復制的增殖效果。

所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2包括：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

所述Slam/V慢病毒表達載體構建，包括Slam/V與pDONR^TM221供體載體進行B、P位點重組獲得入門載體pDONR/Slam/V，以及pDONR/Slam/V與pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表達載體進行L、R位點重組獲得表達克隆pDEST/Slam/V。

所述Slam/V完整慢病毒的獲得，是將pDEST/Slam/V質粒與包裝混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同轉染人胚腎細胞株293-FT，收獲細胞上清，獲得具有感染性的Slam/V復制缺陷型慢病毒樣粒子。