[發明專利]檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201611208173.8
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN108239669B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 龔梅花;王靜靜;羅銀鈴;羅宇芬;李長英;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法和試劑盒，該方法包括：(a)獲取至少一裝載有核酸的芯片和至少一已知序列，該已知序列與核酸上的部分序列互補；形成互補后，核酸在沿已知序列的延伸方向上緊接有兩個特異的待測堿基，第一個堿基與待檢測的可逆性阻斷dNTP互補，第二個堿基與帶熒光的dNTP互補；(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入待檢測的可逆性阻斷dNTP，使已知序列延伸一個堿基；然后加入帶熒光的dNTP，使至少部分序列繼續延伸一個堿基；(c)采集反應后產物的熒光信號，并根據熒光信號的強度推算出待檢測的可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質的含量。本發明的方法能夠進一步評估可逆性阻斷dNTP的純度，并且精確度更高。

技術領域

本發明涉及測序技術領域，尤其涉及一種檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法和試劑盒。

背景技術

近年來，在基因測序技術領域，與其它測序方法相比，邊合成邊測序(sequencingby synthesis,SBS)的測序方法以其通量高、價格低而獲得青睞。在這一測序方法中，可逆性阻斷dNTP是測序的中心也是測序成本最主要和最影響測序質量的一環。在加入每個可逆性阻斷dNTP后，3’阻斷基團的存在阻止其它核苷酸加入合成的鏈中。在去除阻斷基團后，恢復天然游離的3’羥基基團用于加入下一個核苷酸。但是如果由于合成或者存儲等步驟導致非常少量的3′阻斷基團脫落，就會增加測序的定相(Phasing)和預定相(Prephasing)，所謂“定相(Phasing)”是指SBS中的現象，該現象由3’阻斷基團和熒光基團的不完全除去引起，不能通過聚合酶在給定的測序循環中將DNA鏈的一部分完全并入到合成鏈中。“預定相(Prephasing)”是由在不存在有效的3’阻斷基團的情況下，核苷酸并入所引起的，并且該并入事件預先進行了1個循環。這使測序過程移相發生的更嚴重、更快，從而降低讀長，增加錯誤率，降低測序質量。這在不同的測序平臺上都有體現。

可逆性阻斷dNTP，在核苷酸糖基的3'位連一個疊氮基團(結構式是-CH₂N₃)或硫硫鍵、烯丙基作為3’阻斷基團。這個3’阻斷基團在鏈延伸時起到阻止聚合的作用。其中，疊氮基團有一個特性，就是遇到巰基試劑(例如，二巰基丙醇)，會發生斷裂，并在原來的位置留下一個羥基。疊氮基團在常溫下不是很穩定，尤其是3'位的疊氮基脫落，是導致測序時預定相的主要原因。因此，可逆性阻斷dNTP的純度對二代測序的質量有極大影響。

可逆性阻斷dNTP目前使用HPLC(高效液相色譜法)進行提純，純度一般能達到99.0％以上。盡管經過HPLC提純的可逆性阻斷dNTP，純度達到99.0％以上，在測序過程中，由于各種因素比如疊氮基團在常溫下不是很穩定，尤其是3'位的疊氮基脫落，從而導致預定相，影響測序質量，因此需要設計一種質控可逆性阻斷dNTP的方法。

發明內容

本發明提供一種檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法和試劑盒，能夠進一步評估可逆性阻斷dNTP的純度。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，包括：

(a)獲取至少一裝載有核酸的芯片和至少一已知序列，該已知序列與上述核酸上的部分序列互補；形成互補后，上述核酸在沿上述已知序列的延伸方向上緊接有兩個特異的待測堿基，第一個堿基與待檢測的可逆性阻斷dNTP互補，第二個堿基與帶熒光的dNTP互補；

(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入上述待檢測的可逆性阻斷dNTP，使上述已知序列以上述核酸為模板延伸一個堿基；然后加入上述帶熒光的dNTP，使延伸一個堿基后的序列中的至少部分序列繼續延伸一個堿基；

(c)采集反應后的產物的熒光信號，并根據上述熒光信號的強度推算出上述待檢測的可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質的含量。

進一步地，上述兩個特異的待測堿基是不同的堿基。