[發(fā)明專利]檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611208173.8
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN108239669B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔梅花;王靜靜;羅銀鈴;羅宇芬;李長英;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

1.一種檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述方法包括：

（a）獲取至少一裝載有核酸的芯片和至少一已知序列，該已知序列與所述核酸上的部分序列互補(bǔ)；形成互補(bǔ)后，所述核酸在沿所述已知序列的延伸方向上緊接有兩個(gè)特異的待測堿基，第一個(gè)堿基與待檢測的可逆性阻斷dNTP互補(bǔ)，第二個(gè)堿基與帶熒光的dNTP互補(bǔ)，所述兩個(gè)特異的待測堿基是已知的，所述可逆性阻斷dNTP是指脫氧核糖的3’端被阻斷基團(tuán)阻斷的dNTP，所述帶熒光的dNTP是非可逆終止核苷酸；

（b）在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入所述待檢測的可逆性阻斷dNTP，使所述已知序列以所述核酸為模板延伸一個(gè)堿基；然后加入所述帶熒光的dNTP，使延伸一個(gè)堿基后的序列中的至少部分序列繼續(xù)延伸一個(gè)堿基；

（c）采集反應(yīng)后的產(chǎn)物的熒光信號(hào)，并根據(jù)所述熒光信號(hào)的強(qiáng)度推算出所述待檢測的可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)的含量，所述推算依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線包括自然dNTP的濃度與所述濃度對應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度的函數(shù)關(guān)系，其中所述自然dNTP與所述第一個(gè)堿基互補(bǔ)；

所述方法還包括制作所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟：

（d）在DNA聚合酶的作用下，首先加入不同濃度的所述自然dNTP，使所述已知序列以所述核酸為模板延伸一個(gè)堿基；然后加入所述帶熒光的dNTP，使延伸一個(gè)堿基后的序列中至少部分序列繼續(xù)延伸一個(gè)堿基；

（e）采集反應(yīng)后的產(chǎn)物的熒光信號(hào)，并根據(jù)所述自然dNTP的濃度與所述熒光信號(hào)的強(qiáng)度關(guān)系制作所述標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述兩個(gè)特異的待測堿基是不同的堿基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²≥0.95。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述步驟（d）與所述步驟（b）同步進(jìn)行；所述步驟（e）與所述步驟（c）同步進(jìn)行。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述步驟（b）和所述步驟（c）至少重復(fù)三次，所述非阻斷雜質(zhì)的含量是所有重復(fù)結(jié)果的平均值。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述步驟（b）還包括加入已知濃度的自然dNTP，所述自然dNTP與所述第一個(gè)堿基互補(bǔ)。