[發明專利]檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201611208173.8
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN108239669B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 龔梅花;王靜靜;羅銀鈴;羅宇芬;李長英;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

1.一種檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，其特征在于，所述方法包括：

（a）獲取至少一裝載有核酸的芯片和至少一已知序列，該已知序列與所述核酸上的部分序列互補；形成互補后，所述核酸在沿所述已知序列的延伸方向上緊接有兩個特異的待測堿基，第一個堿基與待檢測的可逆性阻斷dNTP互補，第二個堿基與帶熒光的dNTP互補，所述兩個特異的待測堿基是已知的，所述可逆性阻斷dNTP是指脫氧核糖的3’端被阻斷基團阻斷的dNTP，所述帶熒光的dNTP是非可逆終止核苷酸；

（b）在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入所述待檢測的可逆性阻斷dNTP，使所述已知序列以所述核酸為模板延伸一個堿基；然后加入所述帶熒光的dNTP，使延伸一個堿基后的序列中的至少部分序列繼續延伸一個堿基；

（c）采集反應后的產物的熒光信號，并根據所述熒光信號的強度推算出所述待檢測的可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質的含量，所述推算依據標準曲線進行，所述標準曲線包括自然dNTP的濃度與所述濃度對應的熒光信號強度的函數關系，其中所述自然dNTP與所述第一個堿基互補；

所述方法還包括制作所述標準曲線的步驟：

（d）在DNA聚合酶的作用下，首先加入不同濃度的所述自然dNTP，使所述已知序列以所述核酸為模板延伸一個堿基；然后加入所述帶熒光的dNTP，使延伸一個堿基后的序列中至少部分序列繼續延伸一個堿基；

（e）采集反應后的產物的熒光信號，并根據所述自然dNTP的濃度與所述熒光信號的強度關系制作所述標準曲線。

2.根據權利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，其特征在于，所述兩個特異的待測堿基是不同的堿基。

3.根據權利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，其特征在于，所述標準曲線的R²≥0.95。

4.根據權利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，其特征在于，所述步驟（d）與所述步驟（b）同步進行；所述步驟（e）與所述步驟（c）同步進行。

5.根據權利要求1所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，其特征在于，所述步驟（b）和所述步驟（c）至少重復三次，所述非阻斷雜質的含量是所有重復結果的平均值。

6.根據權利要求5所述的檢測可逆性阻斷dNTP中非阻斷雜質含量的方法，其特征在于，所述步驟（b）還包括加入已知濃度的自然dNTP，所述自然dNTP與所述第一個堿基互補。