[發明專利]一種檢測軍團菌并區分嗜肺軍團菌的檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201611207887.7
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN108239672A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 郭圣明;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海星耀醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種檢測軍團菌并區分嗜肺軍團菌的檢測試劑盒，利用TaqMan探針多色熒光PCR技術，選擇在16S rRNA基因和mip基因序列位點分別設計軍團菌特異性的引物探針和嗜肺軍團菌特異性引物探針，對引物探針以及擴增體系進行優化驗證，確定擴增效果最優的引物探針序列、引物探針的最優組合、最優擴增體系組分濃度以及試驗運行程序，檢測過程僅憑不同熒光標記的探針檢測就能檢測出軍團菌并對其中的嗜肺軍團菌進行區分；同時本發明還引入了人工構建的內參對照，用于避免檢測結果的假陰性。本發明的檢測結果穩定可靠，試劑盒使用方便，檢測靈敏度高，適合于環境、疾控以及臨床中軍團菌和嗜肺軍團菌的快速檢測。

技術領域

本發明為一種檢測軍團菌并區分嗜肺軍團菌的檢測試劑盒。

背景技術

軍團菌（Legionella spp）是非典型肺炎(Atypical pneumonias)的主要病原菌之一，軍團菌于該病首發于1976年的美國一次軍人聚會，故稱作軍團病。次年從死者肺組織中分離出一種新的病原體，1978年國際上正式將該病原體命名為嗜肺軍團菌。軍團菌不僅能產生多種毒素和酶，還能誘導人末梢血單核細胞產生前凝血因子活性物質，有助于感染過程中發生播散性血管內凝血。肺部感染后細菌合成的毒素、酶可逆行經支氣管、淋巴管及血行播散到其他部位。少數細胞免疫功能低下者，本菌可引起菌血癥。軍團病常見的多系統臟器損傷主要由毒血癥引起，細菌直接侵犯肺外器官組織的情況少見。產生的多種酶和毒素是導致患者死亡的主要原因。軍團菌除暴發流行外，多半為散發性社區獲得性肺炎。軍團菌占社區獲得性肺炎的2%～6% ，但在入院的TCU獲得性肺炎患者中卻占12%～23%，為第二位,僅次于肺炎鏈球菌，是重癥肺炎的重要病原菌，且研究發現，嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)檢出率最高，在臨床上引起的危害也比其它軍團菌屬細菌更嚴重。

軍團菌的營養要求苛刻，生長緩慢，在氧氣含量低的情況下生長速度會進一步減慢，因此軍團菌的最終鑒定需要綜合它的生物學特性進行綜合分析，即形態、生化性狀、分子生物學檢測、抗體檢測（IFA、ELISA）。(1)顯微鏡檢查：涂片革蘭染色及Gimenez 染色，但意義不大(2) 抗體檢測作為檢測軍團菌感染臨床常用手段，檢測病人血清中抗軍團菌IgM及IgG 抗體可以做出特異性診斷。但檢測的靈敏度不夠，也有出現交叉反應而導致假陽性結果的產生。抗體檢測的另一局限性是無法對新出現的血清型進行鑒定，需要制作新的抗體血清。(3)通過傳統生化反應觀察菌落形態、染色特征和某些生化反應，可以將軍團菌鑒定到屬的水平。但是大部分傳統的生化實驗對軍團菌都是惰性的。近年來，隨著分子生物學的進展，實時熒光PCR技術在病原體檢測中得到廣泛應用，和傳統PCR電泳檢測方法比較具有許多優點：(1)其采用的閉管檢測消擴增產物污染問題，提高了檢測準確度；(2)PCR體系中增加了熒光探針，提高了檢測特異性和靈敏度；(3)操作迅速，無需傳統PCR的后處理檢測步驟，自動化程度高。如果在反應體系中引入內參照和雙波長熒光探針，還能監測因樣品中可能的PCR抑制劑引起的檢測結果假陰性。

目前，臨床實驗室中已經有利用熒光PCR檢測軍團菌并區分嗜肺軍團菌的報道，例如Templeton等(J Clin Microbiol，2003(41)：4016-4021)利用分子信標(MolecularBeacon)多色熒光PCR技術檢測軍團菌16S rRNA、mip基因以及外標內參基因PhHV，將嗜肺軍團菌和其它軍團菌相區分。Stolhaug等(Appl Environ Microbiol，2006(72)：6394-6398)利用FRET探針熒光PCR技術檢測軍團菌16SrRNA基因，并通過擴增產物的熔解曲線分析將嗜肺軍團菌和其它軍團菌相區分；但可以分析，由于不同血清型菌株基因序列變化，嗜肺軍團菌熔解曲線可能會因特征不明顯而導致結果無法判斷。