[發明專利]一種檢測軍團菌并區分嗜肺軍團菌的檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201611207887.7
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN108239672A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 郭圣明;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海星耀醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明為一種檢測軍團菌并區分嗜肺軍團菌的檢測試劑盒，其特征在于，基于軍團菌靶序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2設計多對引物探針，并對所設計的引物探針進行試驗驗證、濃度優化，同時對擴增體系中的重要組分及擴增程序進行優化，確定擴增效果最優的引物探針序列、最優擴增體系以及試驗運行程序，通過TaqMan探針多波長熒光PCR技術單管擴增檢測痰液及肺泡灌洗液中軍團菌，并對其中的嗜肺軍團菌進行區分鑒別。

2.如權利要求1所述，其特征在于，所用靶序列SEQ ID No.1為軍團菌16Sr RNA基因中能用于區分軍團菌的保守序列，所用靶序列SEQ ID No.2為軍團菌mip基因中能用于特異性區分嗜肺軍團菌的保守序列，根據SEQ ID No.1序列優化設計后的引物能擴增其連續145-160個核苷酸，根據SEQ ID No.2序列優化設計后的引物能擴增其連續和90-98個核苷酸，設計的兩種TaqMan探針熒光水解探針能分別檢測軍團菌和嗜肺軍團菌，所述引物長度為18～24個核苷酸、探針長度24～26個核苷酸。

3.如權利要求2所述，其特征在于，試劑盒所用的軍團菌引物序列可以為SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的序列，嗜肺軍團菌引物序列可以為SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7的序列；軍團菌熒光探針可以為SEQ ID No.8序列，其5’端標記FAM熒光基團；嗜肺軍團菌熒光探針可以為SEQ ID No.9序列，其5’端標記HEX；兩條探針3’端標記BHQ1淬滅基團；引物探針序列也可以是上述序列同源性大于85％以上。

4.如權利要求1所述的方法與試劑盒，其特征在于，引入了一個人工構建的內參照系統用于避免檢測結果假陰性，內參對照系統包括內參探針和內參DNA。

5.如權利要求4所述，其特征在于，內參引物、探針分別采用SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12序列，探針5’端標記Cy5熒光基團，3’端標記BHQ3淬滅基團；內參探針也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。

6.如權利要求1所述方法和引物探針建立的試劑盒，包括PCR緩沖液、引物探針、DNA聚合酶、內參對照、陰性對照、陽性對照以及臨界陽性對照。

7.如權利要求1所述方法和引物探針建立的試劑盒，其特征在于按照以下濃度配制成的反應體系進行擴增反應：Tris-HCl(pH8.3) 15mM、KCl 75mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl₂ 3mM、引物各0.3μM、軍團菌熒光探針和嗜肺軍團菌熒光探針及內參熒光探針各0.2μM、Taq DNA聚合酶1.2U、UNG酶0.05U。

8.如權利要求1所述試劑盒在軍團菌和嗜肺軍團菌快速鑒定中的應用，包括以下步驟：(1)樣本處理提取模板DNA，樣本為痰液、咽拭子、支氣管肺泡灌洗液等臨床樣本或水、空氣樣品；(2)模板DNA擴增檢測，以熒光PCR儀上三個檢測通道擴增模板的熒光信號強弱和循環閾值來判斷樣品中軍團菌和嗜肺軍團菌存在，從而檢測樣品中軍團菌，并對其中的嗜肺軍團菌進行區分辨別。

9.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于：所述的熒光PCR最優擴增程序如下：

[1] 50℃ 2 min

[2] 94℃ 5 min

[3] 94℃ 10 s

[4] 60℃ 45 s

[5] Go to [3] ，5 cycles

[6] 94℃ 10 s

[7] 60℃ 45 s

[8] Go to [6] ，40 cycles

在第[7]步采集FAM、JOE和CY5通道熒光信號

[9] End。