[發明專利]用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物組、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201611207629.9
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106755416B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 常小麗;楊文鈺;付瑤;何宛芹;楊繼芝;武曉玲;雍太文;尚靜
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 秦力軍

本發明提供一種用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物組、試劑盒及其應用，涉及生物檢測領域，其由：具有如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物；具有如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物；具有如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物；具有如SEQ ID NO.4所示的第四正向引物中的一種或多種，以及具有如SEQ ID NO.5所示的共用反向引物組成。將本發明的特異性引物應用于由鐮孢菌引起的大豆根腐病的檢測可以快速分辨出引起大豆根腐病的鐮孢菌，并根據檢測結果所顯示的條帶大小確定鐮孢菌的種類，從而為大豆根腐病的綜合防治提供依據。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，尤其涉及一種分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的檢測。

背景技術

大豆根腐病(Soybean root rot)是大豆生產中分布范圍廣、危害嚴重、防治較為困難的一種真菌性土傳病害。大豆根腐病致病菌群體復雜多樣，鐮孢菌是其重要的致病類群之一。國內外已報道的主要有腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、木賊鐮孢菌(F.equiseti)、層生鐮孢菌(F.proliferatum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudoproliferatum)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、半裸鐮孢菌(F.semitectum)、F.tricinctum和F.armeniacum等。我國西南地區主要以腐皮鐮孢菌(F.solani)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和木賊鐮孢菌(F.equiseti)為大豆根腐病主要致病鐮孢菌。由于引起大豆根腐病的病原菌成分復雜，尤其是鐮孢菌的種類繁多，為實現大豆根腐病的快速檢測和有效防治，必須首先對大豆根腐病的致病菌，尤其是主要致病鐮孢菌的多樣性進行分析。

傳統的鐮孢菌鑒定主要依據其形態培養特征及致病性檢測，不僅費時、費力、成本高、準確性差，而且檢測者需具備較好的植物病理學專業背景。基于DNA序列的PCR擴增技術為鐮孢菌的鑒定提供了較大幫助。據文獻報道，PCR-RFLP、LAMP技術、RFLP-DGGP等PCR技術先后被應用于大豆根腐病病原菌的檢測。以rDNA-ITS序列為代表的多個DNA分子標記被用到鐮孢菌檢測中，但rDNA-ITS在鐮孢菌屬內種間或復合種間相對保守，變異位點較少，不能很好地將各種致病鐮孢菌分開，例如O’Donnell等(2015)在研究用于鐮孢菌屬內種間及復合種內群體的多種DNA分子標記時，亦發現rDNA-ITS在屬內種間相對保守，不適合鐮孢菌的群體鑒定。而且目前方法多涉及單一鐮孢菌種的鑒定或檢測，考慮到大豆根腐病致病鐮孢菌的群體多樣性，目前亟需開發一系列用于鐮孢菌多樣性檢測的分子技術。

申請號為201310353895.2公開了一種用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物，該申請僅利用一個特異性引物實現對多種致病菌的分析和檢測，其原理是基于酵母基因組中18sRNA基因設計一對特異引物，依據擴增片段大小不同達到區分多種真菌的目的，但是由于該基因序列相對保守，序列之間差異較小的，雖然該申請檢測了11個相關真菌，但是不排除環境樣本中其他真菌亦可被擴增出相同的條帶，從而無法確定是否存在相應的致病菌，并且，由于該體系需要進行普通PCR和DGGE分層兩個步驟，因此其檢測過程耗時長達12h左右。

發明內容

為解決現有技術存在的技術問題，本發明提供一種方法簡單，檢測時間短的分析大豆鐮孢根腐病真菌多樣性的特異性引物組，以及將其應用于大豆根腐病檢測的方法，利用本發明提供的特異性引物組可以準確、高效的判斷由鐮孢根腐真菌引起的大豆根腐病。

為實現本發明的技術目的，本發明第一方面提供一種用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物組，所述引物組包括：

具有如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物；

具有如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物；

具有如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物；