[發明專利]一種高粱體細胞懸浮培養方法及應用

有效

• 申請號: 201611204000.9
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106613978B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 郝艷芳;張微;劉勇;王良群;馬涌;楊偉;白鴻雁;武擘;侯麗萍;張曉娟
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院高粱研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 潘宏偉

本發明公開了一種高粱體細胞懸浮培養方法，具體包括以下步驟：高粱種子先用70％乙醇浸泡1?3min，再用無菌水沖洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10?20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫?20，最后無菌水沖洗，得到無菌高粱種子；制備高粱愈傷組織；選取合適的愈傷組織接種于液體培養基中培養，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42?45天后獲得高粱體細胞懸浮系。本發明的細胞懸浮培養方法，愈傷誘導率高，建立的細胞懸浮系不褐化，容易觀察，且懸浮細胞系細胞密度大，游離細胞體積小，細胞質濃厚，近圓形細胞比例達70％以上，活細胞率達60％以上，細胞分裂生長旺盛。

技術領域

本發明屬于植物細胞培養技術領域，具體涉及一種高粱體細胞懸浮培養方法及應用。

背景技術

高粱品種資源創新不足是目前高粱育種中面臨的最大問題，創造具有豐富遺傳基礎的資源材料是高粱育種工作者研究的重點之一。實踐證明，育種新技術的開發應用對高粱育種材料的創新是非常重要的。生物技術是世界新技術革命的主要內容之一，為培育高產、多抗、優良的農作物新品種提供了科學的手段。

近年來,植物細胞和組織培養作為植物生物技術的組成部分被應用于作物育種后,取得了一系列重大進展與突破,在作物品種改良上發揮了很大的作用。與植物組織培養相比,植物細胞培養屬技術層次更高的培養技術,它是指以離體的單細胞或細胞團為外植體，在無菌條件下進行培養，增殖形成新的細胞團，經再分化形成完整植株的技術。細胞培養具有群體數量大、誘變率高、易于篩選等優點,不僅可以應用于原生質體分離、培養與雜交，基因轉移和生產次生代謝物等，還可以在細胞水平上短期篩選出預期突變體，為作物品種改良提供了一種新途徑。很多植物的體細胞懸浮培養已獲得成功，其在作物育種方面的應用也很廣泛。

在禾谷類作物中，對水稻、玉米、小麥、大麥等作物的細胞懸浮培養研究較多，并已得到原生質體再生植株，其中對水稻的研究比較深入，不僅進行了遺傳轉化和突變體的篩選，還培育出了新品種。但是，目前尚沒有一種比較成熟的高粱體細胞懸浮培養方法，影響了高粱育種工作的開展。

發明內容

本發明的目的是提供一種高粱體細胞懸浮培養方法及應用，愈傷誘導率高，建立的細胞懸浮系不褐化，容易觀察，且懸浮細胞系中游離細胞體積小，細胞質濃厚，細胞分裂生長旺盛，在高粱育種方面具有良好的應用前景。

本發明提供的一種高粱體細胞懸浮培養方法，具體包括以下步驟：

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇浸泡1-3min，再用無菌水沖洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10-20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗，得到無菌高粱種子；

步驟2，制備高粱愈傷組織；

步驟3，高粱體細胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養基中，接種比例為2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培養，每隔7天繼代一次；每次繼代時，將新、舊液體培養基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養的培養基，總共培養42-45天后獲得高粱體細胞懸浮系；

所述液體培養基為：每升MS培養基中添加1mg的2,4-D和30g的蔗糖，pH為5.8。

優選的，步驟1中，高粱種子先用70％乙醇浸泡1min后，再用無菌水沖洗2-3次；HgCl₂水溶液浸泡15min后，用無菌水沖洗5-6次。

優選的，步驟2中，制備高粱愈傷組織，具體包括：