[發(fā)明專利]流式細胞術快速檢測大腸桿菌O157:H7的方法

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• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106841011A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設計）人: 李延斌;王靈;王蓉暉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發(fā)明屬于食品快速檢測領域，涉及食源性致病菌大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)的快速檢測，尤其是一種基于流式細胞術的熒光定量檢測食品中的食源性致病菌的檢測方法。

背景技術

食源性疾病長期損傷我們的臟器并有致命性。主要的食源性致病菌包括Salmonella enteric subspecies I serovar Typhimurium,Escherichia coli O157:H7,Listeria monocytogenes,Staphylococcus aureus,Campylobacter jejuni,Clostridium perfringens,和Yersinia enterocolitica，它們對食品工業(yè)和消費者產生了巨大影響。2010年5月傳染病研究與政策中心(CIDRAP)宣布：美國農業(yè)部(USDA)最新估計每年E.coli和Salmonella花費近31.3億美元。在北美、英國和日本，E.coli O157：H7是EHEC致病菌中最重要的，屬于主要食源性致病菌的前五位之一，曾報道在菠菜、生菜、蘋果酒、哈密瓜、蘿卜芽以及碎牛肉中有污染，感染劑量小于100個菌體細胞。E.coli O157:H7的傳染主要是經過糞口途徑，但是也可以通過接觸被污染的水源、感染動物或人類進行感染，主要導致腸道疾病。在美國1990年至2010年期間，由E.coli爆發(fā)引起的食品安全事件有361起，其中由E.coli O157:H7引起的有303起，在美國平均每年導致9,6000人感染，31人死亡。

一個有效的途徑來阻止污染的商業(yè)食品被引入人類食物鏈就是在最初的控制點進行監(jiān)測。因此在食品安全中對于食品中微生物致病菌的識別和檢測預防有重要意義。在根據(jù)Arnandis-Chover等最近的報道，在2011年歐洲就有進行了27.5千萬次的食品中微生物檢測試驗，預計到2016年會有35千萬次的食品微生物檢測試驗。

傳統(tǒng)檢測致病微生物的方法主要依賴于特異性的微生物和生化鑒定。如圖1所示，傳統(tǒng)方法有：培養(yǎng)和菌落計數(shù)法，基于免疫學的方法以及PCR(polymerase chain reaction)方法^[5]。這些方法很靈敏、費用低廉并且可以定性和定量判定被檢微生物，但是它們很大程度上被檢測時間所限制，并且如果要檢出食品樣品中低濃度的致病菌就需要進行樣品的前富集。

綜上可知傳統(tǒng)方法通常費時，這就需要一個新的技術能快速、簡便、特異、靈敏、可靠地檢測食源性致病菌。而且這種新技術應該可以較低的成本在原地實時監(jiān)測。生物傳感器是對生物物質敏感并將其響應轉換為可識別的信號進行檢測的分析儀器。主要由兩部分組成：可以識別靶標分析物的生物識別元件和能把識別信號轉換為可測量的電信號的換能器。生物識別元件可以是組織、微生物、細胞器、細胞、酶、抗體、核酸和仿生材料等。近年來隨著細胞生物學的飛速發(fā)展，細胞作為生物傳感器的識別元件被用于致病菌的檢測中已經日益突顯了其無可比擬的優(yōu)越性。一些基于哺乳動物細胞的CBBs的檢測系統(tǒng)已經達成了商業(yè)化，諸如(a)電細胞基質的阻抗傳感器(electric cell-substrate impedance sensing，ECIS)可以檢測細胞培養(yǎng)物中的阻抗改變，該方法檢測時間較長；(b)CANARY系統(tǒng)，在B細胞(B淋巴細胞)表面構建了致病菌特異性的抗體，在B細胞質內表達生物發(fā)光鈣離子響應蛋白，當抗原與B細胞表面的抗體結合后啟動信號通路從而導致胞內的鈣離子激流可使B細胞發(fā)光，可以用光度計進行檢測，該方法雖然檢測時間較短，但是樣品需要通過離心的方法進行前富集；(c)生物電識別系統(tǒng)(BERA)使用了電穿孔的方法構建了抗體或其他分子到哺乳動物細胞膜，當結合了諸如病毒粒子的分析物后，抗體就開啟了膜電位的改變，這可以用微電極檢測到，該方法的工作電極不可重復利用。

這類哺乳動物細胞的CBBs被用于食品、農業(yè)和生物安全方面的致病性微生物和毒素的檢測，在生物傳感器領域的增長率達到了11.2％，這說明了在該領域需要發(fā)展新型的功能化的CBBs。

SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒光信號檢測出染色后的細菌數(shù)量。