[發明專利]一種植物等位基因不平衡表達檢測方法

有效

• 申請號: 201611200502.4
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106755408B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 張德強;宋躍朋;次東
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 王加貴

1.一種植物等位基因不平衡表達的檢測方法，步驟如下：

1)比較候選基因序列，篩選出標記等位基因的SNPs位點；

2)根據所述步驟1)篩選到的SNPs位點設計qPCR特異引物和簡并引物，所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對正向引物或反向引物3'末端與SNP位點3'末端互補的核苷酸進行LNA修飾；

3)用所述qPCR特異引物和簡并引物分別對待測樣本的cDNA進行PCR擴增，獲得擴增產物；在PCR擴增過程中監測擴增曲線，在PCR擴增結束后檢測擴增產物的熔解曲線；

4)若擴增產物的熔解曲線為單峰，根據PCR擴增的Ct值計算得到待測樣本等位基因不平衡表達特異性；

所述標記等位基因SNPs位點位于候選基因3'端的不保守區域；

所述待測樣本為毛果楊或巨桉；

當待測樣品為毛果楊時，所述SNP位點位于熱激轉錄因子基因2上；所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和反向引物SEQ ID NO.4；所述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的3'末端上的倒數第二個核苷酸進行LNA修飾；所述簡并引物包括正向簡并引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4；

當待測樣品為巨桉時，所述SNP位點位于MYB轉錄因子基因上；所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和反向引物SEQ ID NO.8；所述SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6的3'末端上的倒數第二個核苷酸進行LNA修飾；所述簡并引物包括正向簡并引物SEQID NO.7和反向引物SEQ ID NO.8。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣本cDNA的PCR擴增程序為：預變性94℃3min；變性94℃10s，退火62℃30s，延伸72℃40s；40個循環。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣本cDNA的PCR擴增體系包括：20ng/μL的待測樣品cDNA，1μL；2×SYBR PremixEx TaqTM，10μL；10μM的正向引物0.5μL；10μM的反向引物0.5μL；雙蒸水8μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣本等位基因不平衡表達特異性計算的公式為2^-ΔCt，ΔCt＝候選等位基因基因型R的Ct值-候選等位基因基因型R’的Ct值；所述基因型R為A、T、C和G中的一種，所述基因型R’為A、T、C和G中除R以外的三種中的一種。