[發(fā)明專利]一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611200502.4
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106755408B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張德強(qiáng);宋躍朋;次東
• 申請（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 王加貴

本發(fā)明提供了一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測方法，包括以下步驟：1)比較候選基因序列，篩選標(biāo)記等位基因的SNPs位點；2)根據(jù)篩選到的SNPs位點設(shè)計qPCR特異引物和簡并引物；3)用qPCR特異引物和簡并引物分別對待測樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；4)若擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，根據(jù)PCR擴(kuò)增的Ct值計算待測樣本等位基因表達(dá)特異性；所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對引物3'末端與SNP位點3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾。所述方法增加了檢測結(jié)果的精確性和可靠性，并且簡化了實驗配套條件，顯著地降低了實驗成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因表達(dá)檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測方法。

背景技術(shù)

等位基因(allele又作allelomorph)一般指位于一對同源染色體的相同位置上控制著相對性狀的一對基因。

等位基因的不平衡表達(dá)(allelic expression imbalance，AEI)為同一個細(xì)胞內(nèi)，每個基因通常有2個拷貝，由于順式作用使基因的2個拷貝的表達(dá)比例偏離了1：l。等位基因的不平衡表達(dá)現(xiàn)象普遍存在，除了遺傳印跡基因的絕對不平衡表達(dá)外，有相當(dāng)數(shù)量的基因在部分個體、同一個體不同時空上存在AEI。并與基因組一些特定區(qū)域的多態(tài)位點相關(guān)。

目前，常用的等位基因不平衡表達(dá)檢測主要有基于電泳技術(shù)采用限制性片段長度多態(tài)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)、測序法、表達(dá)譜芯片法以及SNaPshot技術(shù)，測序法和SNaPshot價格比較昂貴，且須以相關(guān)的大型儀器平臺作為支撐，實驗操作靈活性差。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種等位基因不平衡表達(dá)檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中等位基因不平衡表達(dá)檢測成本高、準(zhǔn)確性差的問題。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測的方法，包括以下步驟：

1)比較候選基因序列，篩選出標(biāo)記等位基因的SNPs位點；

2)根據(jù)所述步驟1)篩選到的SNPs位點設(shè)計qPCR特異引物和簡并引物，所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對正向引物或反向引物3'末端與SNP位點3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾；

3)用所述qPCR特異引物和簡并引物分別對待測樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；在PCR擴(kuò)增過程中檢測擴(kuò)增曲線，在PCR擴(kuò)增結(jié)束后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線；

4)若擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，根據(jù)PCR擴(kuò)增的Ct值計算得到待測樣本等位基因表達(dá)特異性；

所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對引物3'末端與SNP位點3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾。

優(yōu)選的，步驟3)中所述待測樣本為林木樹種。

優(yōu)選的，所述待測樣本為毛果楊或巨桉。

優(yōu)選的，當(dāng)待測樣品為毛果楊時，所述SNP位點位于熱激轉(zhuǎn)錄因子基因2上。

優(yōu)選的，所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和反向引物SEQ ID NO.4；所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的3'末端上的倒數(shù)第二個核苷酸進(jìn)行LNA修飾；所述簡并引物包括正向簡并引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4。

優(yōu)選的，當(dāng)待測樣品為巨桉時，所述SNP位點位于MYB轉(zhuǎn)錄因子基因上。