[發(fā)明專利]一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611196754.4
• 申請日: 2016-12-21
• 公開（公告）號: CN106754811B
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹林;張力軍;聶俊偉;齊心;韓錦雄;瞿志鵬;徐曉昱
• 申請（專利權(quán)）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/10;C12N15/70;C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 杜靜;徐冬濤

一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶及其制備方法和應(yīng)用，對現(xiàn)有EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行降低DNA偏好性的定點突變，所述定點突變是指D97E，D188E、E326D中的至少兩個，所述定點突變改進(jìn)了Tn5轉(zhuǎn)座酶蛋白序列和構(gòu)象，并配合對反應(yīng)體系的微調(diào)，改進(jìn)Tn5轉(zhuǎn)座酶對DNA靶序列插入的偏好性，顯著改善了DNA建庫均一性，并使建庫結(jié)果具有更好的覆蓋度，顯著提高建庫均一性，適應(yīng)高通量測序建庫的需求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)座酶是一大類細(xì)菌來源的蛋白，通過結(jié)合轉(zhuǎn)座子序列末端并催化其移動到基因組上隨機位置實現(xiàn)“剪切-粘貼”或“復(fù)制-粘貼”型的DNA插入的作用。轉(zhuǎn)座酶的種類很多，最先被發(fā)現(xiàn)的是能使玉米隨機改變顏色的Tn3轉(zhuǎn)座子。天然的轉(zhuǎn)座子在生物中活性很低，在進(jìn)化過程中起到隨機改變遺傳物質(zhì)并推動進(jìn)化的重要作用。轉(zhuǎn)座酶可以在基因組上引入隨機突變的重要性質(zhì)也被應(yīng)用于最近迅速發(fā)展的二代測序技術(shù)中的建庫過程，可以在基因組上隨機加入已知序列接頭用于測序分析。

Tn5轉(zhuǎn)座酶是轉(zhuǎn)座酶的一種，Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行轉(zhuǎn)座功能的實現(xiàn)需要三個部分共同作用：轉(zhuǎn)座子序列、轉(zhuǎn)座酶、靶DNA位置。野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶的活性也是很低的，以減少對宿主產(chǎn)生致命突變的風(fēng)險。

Tn5轉(zhuǎn)座酶活性很低的部分原因在于其蛋白的N端和C端在三維空間構(gòu)象上相互接近，并發(fā)揮相互抑制的作用。對于N端或C端的突變可以得到高活性形式的突變形轉(zhuǎn)座酶，如L372P，正常的372位亮氨酸處于一個α螺旋中，用丙氨酸取代后使α螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，從而產(chǎn)生了C端構(gòu)象的改變，與N端在空間上發(fā)生分離，從而得到活性大大增加的突變蛋白。同時Tn5蛋白含有一個中心催化結(jié)構(gòu)域DDE，即不同位置的D/D/E三個殘基在三維構(gòu)象上形成一個中心的酸性基團(tuán)，構(gòu)成能結(jié)合二價離子的環(huán)形位置，該結(jié)構(gòu)域的已知功能為促進(jìn)蛋白在DNA上的行進(jìn)，對這三個酸性殘基的分別交換突變可以得到催化性增加、行進(jìn)性提升的突變蛋白。

目前主流技術(shù)為對轉(zhuǎn)座酶表達(dá)序列進(jìn)行定點突變，通過原核表達(dá)產(chǎn)生有活性的突變蛋白，對其功能進(jìn)行體外驗證。由此得到最知名的突變即為上文提到的，N端和C端空間距離得到高活性蛋白和改變催化基團(tuán)DDE基團(tuán)內(nèi)殘基得到的催化活性增加的突變蛋白。

雖然現(xiàn)在主流使用的突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座插入活性和對DNA的親和性都得到了有效增強，但在目前酶的活性和穩(wěn)定性提升的基礎(chǔ)上還是存在靶DNA序列偏好性，偏好性是轉(zhuǎn)座酶應(yīng)用于建庫的一個短板，在建庫過程中加接頭的偏好性會導(dǎo)致結(jié)果的不均一和缺失，導(dǎo)致結(jié)果的覆蓋度有問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶及其制備方法和應(yīng)用，降低Tn5轉(zhuǎn)座酶對DNA靶序列插入位點選擇性，使測序DNA建庫分布更均一，并具有更好的覆蓋度，適應(yīng)高通量測序建庫的需求。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶，所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列為EK/LPTn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列定點突變所得，所述定點突變是指D97E，D188E、E326D中的至少兩個；其中，突變位點1：D97E，即EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶基酸序列中第97位的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼幔煌蛔兾稽c2：D188E，即EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶基酸序列中第188位的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼幔煌蛔兾稽c3：E326D，即EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶基酸序列中第326位的谷氨酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

優(yōu)選的，一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶，包含3個定點突變：D97E，D188E、E326D，該突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本發(fā)明還提供編碼氨基酸序列如SEQ NO.2所示的突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的基因。