[發(fā)明專(zhuān)利]一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611196754.4
• 申請(qǐng)日: 2016-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106754811B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹林;張力軍;聶俊偉;齊心;韓錦雄;瞿志鵬;徐曉昱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/12
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/12;C12N15/54;C12N15/10;C12N15/70;C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京天華專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 杜靜;徐冬濤

1.一種突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶，其特征在于，所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列為EK/LPTn5轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列定點(diǎn)突變所得，所述定點(diǎn)突變是指D97E、D188E、E326D中的至少兩個(gè)；

其中，突變位點(diǎn)1：D97E，即EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶基酸序列中第97位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?/p>

突變位點(diǎn)2：D188E，即EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶基酸序列中第188位的天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?/p>

突變位點(diǎn)3：E326D，即EK/LP Tn5轉(zhuǎn)座酶基酸序列中第326位的谷氨酸突變?yōu)樘於彼幔?/p>

編碼所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶，其特征在于，所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶包含3個(gè)定點(diǎn)突變：D97E、D188E、E326D，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶在DNA建庫(kù)中的應(yīng)用。

4.一種利用權(quán)利要求1或2所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行基因組DNA片段化的方法，其特征在于，所述方法的反應(yīng)體系為：10~25mM HEPES緩沖液，pH 7.2~7.6；0.1~5mM beta-巰基乙醇；10~80μg/ml牛血清白蛋白；0.1~0.2M谷氨酸鉀；0.2~0.5mM MnSO₄；0.2~1mM KCl；100~500nM 所述突變型Tn5轉(zhuǎn)座酶；50~100ng 基因組 DNA；0.1~1ng含有19bp 轉(zhuǎn)座子序列的接頭引物；反應(yīng)程序：37℃，10min~1h；

其中，所述接頭引物包括：轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列：AGATGTGTATAAGAGACAG；第一接頭序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC；第二接頭序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG。