[發明專利]一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法

有效

• 申請號: 201611194909.0
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106701816B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 姜國勇;崔從光;王愛華;鄒積華;徐坤
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;中國農業大學煙臺研究院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C07K14/415
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 許靜

本發明涉及一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，步驟為：海帶雌配子體細胞的轉化；重組玉米蛋白z108β在海帶雌配子體細胞中的表達；重組玉米蛋白z108β的提取和純化。本發明首次通過海帶配子體細胞的大量培養獲得純度達到99.9％的重組玉米蛋白，重組玉米蛋白z108β在海帶配子體細胞的表達，使得海帶雌配子體細胞成為一種可以生產生物農藥的生物反應器，本發明在水生植物中表達陸生植物的重組蛋白，而且大規模培養條件下分裂的雌配子體細胞具有目標基因的遺傳穩定性。

技術領域

本發明涉及一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，具體涉及通過基因轉化的方法將玉米蛋白的基因z108β在海帶雌配子體內表達，通過蛋白純化和提取，獲得具有應用價值的重組玉米蛋白z108β。

背景技術

重組玉米蛋白是一種II型核糖體失活蛋白(RIP)，是植物體內一種抑制異源生物體活性的防衛蛋白，其主要功能表現在水解后的蛋白RIP具有兩個肽鏈——α肽和β肽，其中α肽具有N-糖苷酶活性，而β肽具有類凝聚素的Lectin活性。α肽可以專一切割核糖體28RrRNA 4324的腺苷，阻遏延伸因子EF-2與核糖體的結合，從而抑制外源生物有機體的蛋白合成。從玉米胚芽中獲得的z108基因經過重組以后，在大腸桿菌表達的重組蛋白對于黃曲霉(A.flavus)等多種植物病原菌具有抑制孢子萌發的作用，是一種具有抗菌特點的防衛蛋白；而它的β肽鏈能夠獨立地與細胞表面的糖元或半乳糖結合，抑制甜菜夜蛾(S.exigua)等害蟲的取食，表現出一種抑制鱗翅目昆蟲生長的作用。

發明人在過去的研究中已經將玉米的核糖體失活蛋白基因z108轉移到大腸桿菌BL21中，在實驗室條件下提取、純化并獲得重組的抗菌蛋白。2010年獲得了一項發明專利(一種玉米抗菌蛋白的基因及其編碼蛋白的應用ZL200810014139.6)。海帶(L.japonica)屬于褐藻門，是多年生的大型藻類，煙臺市及其周邊沿海的海帶養殖面積達15多萬畝，年產鮮海帶150多萬噸，占全國的80％。海帶中含有多種藥用活性成分，如巖藻聚糖硫酸酯——一種對巨噬細胞、T細胞有直接作用的抗癌藥物。用充氣懸浮培養的海帶雌配子體細胞，生長極快，生物量可每周翻一番，一個月的生物量可提高20倍。重組玉米蛋白z108β基因在海帶雌配子體上表達并實施大規模的細胞培養，是以玉米蛋白抗蟲功能表達作為一種廉價的生物反應器合成生物農藥。

發明內容

本發明將重組玉米蛋白基因z108β在海帶雌配子體內表達，并進行大規模的細胞培養，有助于利用海帶作為海洋生物反應器來生產重組玉米蛋白。

重組玉米蛋白z108β是一個長度為375bp，共有124個氨基酸的小的肽鏈，重組玉米蛋白z108β的核苷酸序列為SEQ ID No.1，氨基酸序列為SEQ ID No.2。重組的玉米蛋白z108β是一個構建在重組質粒pBA002載體中的轉化載體pBA002-z108β，其轉化的作用就是將z108β基因整合到海帶的基因組中，并且讓海帶種苗在海水的生長中表達這樣一個基因，產生這樣一個蛋白。

轉化載體pBA002-z108β的構建：載體質粒pBA002用XbaI/SacI雙酶切，與pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因(經過XbaI/SacI雙酶切)連接，其連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，獲得重組質粒載體pBA002-z108β，-70℃保存。

本發明中基因轉化的方法使用的是基因槍轟擊技術，通過金粒擊打海帶配子體細胞的細胞膜，讓重組質粒載體攜帶重組玉米蛋白的基因整合到海帶染色體的基因組中，并獲得遺傳上穩定的表達。該發明是用基因槍以金粒轟擊海帶配子體的方法再加入質粒共培養可以獲得更多的雌配子體轉化細胞，通過基因檢測也能夠大幅度提高海帶雌配子體細胞的轉化率。

本發明的技術方案如下：

一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，具體步驟如下：

(1)海帶雌配子體細胞的轉化