[發明專利]一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法

有效

• 申請號: 201611194909.0
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106701816B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 姜國勇;崔從光;王愛華;鄒積華;徐坤
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;中國農業大學煙臺研究院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C07K14/415
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 許靜

1.一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）海帶雌配子體細胞的轉化

包括如下步驟：

①生長中的海帶雌配子體細胞品系13號的細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度為5×10⁵-2×10⁶個/mL，轉化時用60mm的無菌培養皿，將雌雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm的圓形轟擊圈；

②用試劑盒提取質粒pBA002-z108β的DNA，用以轟擊后的共培養和基因轉化；

③對海帶雌配子體細胞團進行轟擊：打開PDS-1000\He型基因槍電源，打開氦氣瓶閥門，旋轉氦氣調節桿，使氣壓高于所選可裂膜壓力200psi，即1500psi；擋網與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；

④向轟擊后的海帶配子體細胞團內加入pBA002-z108β質粒DNA，培養溫度是11-13℃，光照為800Lux，共培養48小時；

⑤在草丁膦40mg/L的濃度下篩選轉化的雌配子體細胞；

（2）重組玉米蛋白z108β在海帶雌配子體細胞中的表達

轉化后的雌配子體細胞培養28-35d，挑取克隆單獨培養，將海帶配子體均勻涂布在帶有濾紙的培養皿中，在解剖鏡下用毛細管挑取褐色的轉化體，加入培養液大量培養，培養海帶雌配子體細胞的營養液為：滅菌海水中添加濃度為10.0g/L的NaNO₃和濃度為1.0g/L的KH₂PO₄，其中，NaNO₃溶液的添加量為每升海水添加1.0-10.0mL；KH₂PO₄溶液的添加量為每升海水添加0.4-1mL，并且每天更換一次營養液，培養溫度是11-13℃，每天為光照培養14小時、暗培養10小時，光照為800Lux；將轉化體置于濃度為40mg/L的草丁膦中，選取仍為褐色的轉化體培養5-10d；

（3）重組玉米蛋白z108β的提取和純化

包括如下步驟：

①海帶雌配子體轉化體細胞的破碎和分離

取0.1g轉化培養后的海帶配子體轉化體樣品放入液氮中研磨，加入1×樣品緩沖液200μL，混合后煮沸5min，12000rpm離心10min；

②提取上清液并利用SDS-PAGE電泳鑒定

取20μL上清液，用于點樣檢驗；SDS-PAGE電泳采用10%的分離膠和積層膠；

蛋白樣品上樣，每孔20μL，80V電壓下電泳30分鐘后電壓120V電泳60-80分鐘；

③重組玉米蛋白z108β的蛋白印跡法驗證和純化

海帶雌配子體細胞轉化體的驗證使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置進行PVDF轉膜，電流90mA，轉膜100min，轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的去離子水中，漂洗1分鐘，以洗去膜上的轉膜液，放入封閉液中，搖床上封閉2小時；清洗后將膜浸于稀釋好的一抗中，37℃孵育1-2h；用10mLTBST洗膜3次；再將膜浸于稀釋好的二抗中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色拍照；

獲得的重組玉米蛋白用8kD的再生棉絨纖維素透析膜透析除鹽，并12000rpm離心20分鐘收集沉淀；

④重組蛋白的濃縮和保藏

將離心純化的蛋白集中收集，離心純化后的重組玉米蛋白z108β在-20℃條件下保存；

所述的1×樣品緩沖液的配方為：1.0 M tris-HCL pH 6.8 1mL，10% SDS 6.0mL，β-巰基乙醇0.2mL，ddH₂O 2.8mL；

所述的10%的分離膠的配方為：去離子水 9.9mL，30%丙烯酰胺 8.3mL，Tris-HCL pH8.8 6.3mL，10% SDS 0.25 mL，10% 過硫酸銨 0.25mL，TEMED 0.01mL；

所述的積層膠的配方為：無離子水 5.5mL，30%丙烯酰胺 3.5mL，Tris-HCL pH 8.81.5mL，10% SDS 0.08mL，10%過硫酸銨0.08mL，TEMED 0.008mL；

所述的一抗是由新西蘭大白兔的z108抗血清與5%脫脂奶粉按比例1：1000混合而成；

所述的二抗是由HRP標記的羊抗兔IgG與5%脫脂奶粉按比例1：2000混合而成；

所述的重組玉米蛋白z108β的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。