[發明專利]核酸分子的生成

在審

• 申請號: 201611191085.1
• 申請日: 2008-02-01
• 公開（公告）號: CN107090480A
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: D·J·帕克;K·F·波特;Z·卡恩
• 申請（專利權）人: 杰納羅生物系統有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司11285
• 代理人: 張廣育,姜建成

本申請為分案申請，其原申請的申請日為2008年2月1日，申請號為200880003836.X，名稱為“核酸分子的生成”。

技術領域

本發明在廣義上涉及在增強型固相多核苷酸擴增后生成單鏈核酸分子的方法。本發明還提供了以單鏈及雙鏈核酸分子標記固體基質的方法。用于生成單鏈核酸分子及用于進行擴增反應的試劑盒也形成本發明的一部分。本發明還提供了用于生成任選地以報告分子標記的單鏈核酸分子的擴增體系，以及它們尤其作為標簽、引物和探針的用途。

背景技術

在本說明書中參考的任何現有技術不是并且不能被認為是承認或以任何形式暗示，該現有技術在任何國家組成公知常識的一部分。

通過將鏈分開或者通過去除雙鏈體的一條鏈，可以將雙鏈DNA(dsDNA)轉換成單鏈DNA(ssDNA)。通過熱方式或化學方式破壞鏈間鍵可以將雙鏈體的鏈分開。去除一條鏈使得所需鏈被回收并消除其互補鏈，例如Nikiforov et al.(美國專利No.5,518,900)，其描述了通過以下方式修飾用于擴增的一個或多個引物：在待修飾引物的5’端整合硫代磷酸核苷酸衍生物，使得它抗外切核酸酶降解。在使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增靶序列后，將dsDNA進行外切核酸酶降解。未保護的鏈優選地被通過5’至3’的外切核酸酶消化，剩下包含另一條鏈的單鏈產物。類似策略使用了抗外切核酸酶的分枝引物(branched primer)(Shchepinov et al,Nuc.Acids.Res.25:4441-44541997)或λ外切核酸酶的攜帶5’磷酸的底物偏好性(Higuchi et al,Nucl.Acids Res.25:5685,1989)。

非對稱PCR(Gyllensten and Erlich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7652-76561998；美國專利5,066,584)通過應用不平衡的引物對濃度使得一個引物處于限制濃度，在熱循環過程中生成ssDNA。這有利于由過量引物引發的ssDNA產物。該方法具有的問題是持續合成能力(processivity)方面的固有限制，這是因為所使用的引物必須處于相對低的濃度。

競爭性引物非對稱PCR(Gillespie,1997；美國專利申請08/628,417)采用在PCR熱循環后及進一步熱循環之前分開地添加競爭性引物，以生成ssDNA。照這樣，該方法需要繁瑣的操作，這在特別是診斷環境下是不利的，因為污染風險、使用者的錯誤以及處理時間和成本增加。

Kaltenboeck et al,Biotechniques 12:164-171,1992描述了一種通過以下方式產生ssDNA的方法：最初進行PCR以生成dsDNA，隨后的分開反應是使用第一次PCR的產物作為模板并且采用一個引物進行第二次線性擴增。同樣，該方法需要繁瑣的操作。

固相基質已經被以PCR產物標記，使用的是其中使一個引物綴合于固體表面上的對稱PCR或非對稱PCR，或者是通過其中使正向和反向引物直接綴合于固體表面上的“橋”PCR。這些方法中的每種由于動力學限制(有或無競爭性抑制效應的低效率底物濃度)均是相對低效率的。根據需要，綴合于固相上的dsDNA產物可以被相對簡單地通過化學或熱變性轉換為結合于固相上的ssDNA產物。

美國專利6,277,604描述了在非對稱PCR中使用一個固定的引物和兩個水相引物。至少一個所提供的水相引物的濃度是受限制的，以促進固定引物引發延伸事件。然而，這會導致低效率。

明顯需要開發更有效的方法，用于生成特定的單鏈核酸分子及用于標記固相載體。

發明內容

在本說明書通篇及隨后的權利要求書中，除非上下文中另外要求，否則詞語“包含(comprise)”及變體如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”應被理解為意指包括所述整數或者整數或步驟組，但不排除任何其他整數或整數組。