[發明專利]核酸分子的生成

在審

• 申請號: 201611191085.1
• 申請日: 2008-02-01
• 公開（公告）號: CN107090480A
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: D·J·帕克;K·F·波特;Z·卡恩
• 申請（專利權）人: 杰納羅生物系統有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司11285
• 代理人: 張廣育,姜建成

1.一種用于在反應器中生成單鏈多核苷酸的方法，所述方法包括通過以下方式將雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進行指數擴增：在實現固定引物延伸的反應條件下，將其上具有以連接子方式結合的引物的固體基質與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自：

(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和

(ii)嵌套于兩個水相引物之間的引物；

以有利于生成固定于所述固體基質上的雙鏈多核苷酸，然后使所述固定的多核苷酸處于變性條件以生成一條固定的單鏈多核苷酸及一條液相的單鏈多核苷酸。

2.權利要求1的方法，還包括一個相分離步驟，以分離固定的單鏈多核苷酸或水相的單鏈多核苷酸。

3.一種用于核酸分子的固相擴增的方法，其包括在實現固定引物延伸的反應條件下，將其上具有以連接子方式結合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自：

(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和

(ii)嵌套于兩個水相引物之間的引物。

4.權利要求1或3的方法，其中所述不同熔解溫度是由于以下因素中的一種或多種：不同退火溫度、引物和靶互補多核苷酸之間錯配程度以及/或者外來序列的存在。

5.權利要求4的方法，其中一個或兩個所述引物包含在同源性上與靶互補多核苷酸序列相關或不相關的尾核苷酸序列或頭核苷酸序列，從而提供高于所述另一個引物的熔解溫度。

6.權利要求1、3、4或5的方法，其中所述待擴增的靶標包含凹的5’端或平端，將所述靶標與一種5’至3’外切核酸酶一塊孵育以生成單鏈的多核苷酸模板。

7.一種以單鏈多核苷酸標記固體基質的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有局部退火特性的正向及反向引物進行雙鏈靶多核苷酸或其單鏈的衍生物的指數擴增，將擴增的擴增產物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質或固體基質組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與所述擴增產物的鏈退火，并且將退火條件轉換成所述第二組條件，從而有利于基于基于單引物的擴增以生成固定于所述固體基質上的單鏈多核苷酸。

8.一種用于標記固體基質的方法，其包括在實現固定引物延伸的反應條件下，將其上具有以連接子方式結合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自：

(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和

(ii)嵌套于兩個水相引物之間的引物。

9.權利要求7或8的方法，其中所述不同退火條件或不同熔解溫度是由于以下因素中的一種或多種：不同退火溫度、引物和靶互補多核苷酸之間錯配程度以及/或者外來序列的存在。

10.權利要求9的方法，其中一個或兩個所述引物包含在同源性上與靶互補多核苷酸序列相關或不相關的尾核苷酸序列或頭核苷酸序列，從而提供高于所述另一個引物的熔解溫度。

11.權利要求7、8、9或10的方法，其中所述待擴增的靶標包含凹的5’端或平端，將所述靶標與一種5’至3’外切核酸酶一塊孵育以生成單鏈的多核苷酸模板。

12.權利要求7、8、9或10的方法，還包括在所述反應經受所述第二組退火條件后，轉換回一組允許的退火條件，以有利于在固定的單鏈多核苷酸上生成互補鏈以形成固定于固體基質上的雙鏈體多核苷酸。

13.權利要求1-12任一項的方法，其中所述多核苷酸為DNA。

14.一種在反應器中生成ssDNA的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件(互相允許條件)下具有相似的(平衡的)退火引物但在第二組退火條件(差異允許條件)下具有局部退火特性的一對正向和反向引物在反應器中進行從dsDNA或mRNA靶標到固定的靶ssDNA模板的擴增反應，其中所述擴增被允許在互相允許的退火條件下進行；將條件轉換成差異允許條件以使引物失去平衡，從而基本上在僅存在單引物的情況下有利于線性擴增，以生成ssDNA產物；并且使任何聚合酶活性失活以基本上減少或者阻止dsDNA形成。