[發(fā)明專(zhuān)利]一種I型神經(jīng)纖維瘤病致病突變基因及基于此突變基因的病因?qū)W診斷試劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611189175.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106755399B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 俞萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州艾諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 11282 北京中海智圣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 胡靜<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入國(guó)

本發(fā)明涉及一種I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變及基于此基因突變的病因?qū)W診斷試劑。本發(fā)明提供的神經(jīng)纖維瘤病因?qū)W診斷試劑包括點(diǎn)突變分析試劑盒，所述試劑盒包括1)總RNA提取體系試劑盒：被測(cè)個(gè)體外周靜脈血總RNA提取；2)RNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增體系試劑盒；3)cDNA測(cè)序體系試劑盒；所述cDNA測(cè)序體系試劑盒：對(duì)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA以SEQ ID NO.7?16所示五個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增得到的cDNA五個(gè)大片段以SEQ ID NO.17?60所示引物對(duì)同時(shí)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并與原NF1基因編碼DNA序列比對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物中c.7106G>A，p.W2369X突變存在時(shí)為I型神經(jīng)纖維瘤病患者。本發(fā)明的病因?qū)W診斷試劑省時(shí)、準(zhǔn)確、且檢測(cè)成本低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及基因檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種I型神經(jīng)纖維瘤病致病突變基 因及基于此突變基因的病因?qū)W診斷試劑。

背景技術(shù)

I型神經(jīng)纖維瘤病(Neurofibromatosis type I,NF1)由von Recklinghausen于1882年首 次報(bào)道，故又稱(chēng)為von Recklinghausen病。I型神經(jīng)纖維瘤病一般為常染色體顯性遺傳，部 分為散發(fā)。臨床上主要表現(xiàn)為皮膚咖啡斑、多發(fā)性皮膚軟纖維瘤；非暴露部位(如腋窩、 腹股溝)出現(xiàn)的雀斑和虹膜黑色素錯(cuò)構(gòu)瘤；也可累及多個(gè)器官和系統(tǒng)，如眼、骨骼、血管、 內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)等，并可伴有智力發(fā)育障礙、先天性發(fā)育不良、極罕見(jiàn) 惡變者。

該病由NF1基因發(fā)生突變引起。NF1基因定位于染色體17q11.2，包含57個(gè)組成性外顯子和3個(gè)可變剪接外顯子，全長(zhǎng)283kb，有3個(gè)大小為11～13kb的成熟轉(zhuǎn)錄本，編碼 相對(duì)分子質(zhì)量為327000、由2818個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)纖維(Neurofibromin)蛋白，大量表 達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、性腺細(xì)胞和白細(xì)胞。NF1基 因是腫瘤抑制基因，不少研究表明NF1基因突變可通過(guò)干擾Ras循環(huán)的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路從而引發(fā)腫瘤。NF1基因自發(fā)突變率約為1/10000，是人類(lèi)基因突變率最高的基因位點(diǎn) 之一，約50％患者為新突變，至今仍有未明確的突變點(diǎn)，但發(fā)現(xiàn)了一些突變集中區(qū)域。其 中外顯子4b、7、10b、13、15、20、28，29，31可能為突變熱點(diǎn)，而32號(hào)外顯子突變可 能是中國(guó)人NF1基因突變熱點(diǎn)區(qū)域之一。目前發(fā)現(xiàn)的基因突變已超過(guò)700多種，包括堿基 的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失、移碼突變、拼接突變及染色體平衡易位等。在這些突變中， 約有82％突變?cè)斐缮窠?jīng)纖維蛋白的截短，蛋白的截短對(duì)蛋白的功能結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要的影響。

目前，針對(duì)I型神經(jīng)纖維瘤病高發(fā)病率檢測(cè)的需求日益增加，設(shè)計(jì)研究科學(xué)合理且精 準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒十分必要。由于NF1基因片段較大，突變情況復(fù)雜，易造成漏檢。而該病不同患者的臨床表現(xiàn)不同，且同一家族的不同患者臨床表現(xiàn)也不同，大大增加了臨床診斷的難度，因此建立快速且準(zhǔn)確的診斷技術(shù)、攻克I型神經(jīng)纖維瘤病的診斷難題，對(duì)其臨床 治療和科學(xué)研究都具有重要的價(jià)值。

但目前所發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)不足以解決臨床上I型神經(jīng)纖維瘤病基因篩查、診斷的難題。 尋找新的致病突變，豐富NF1神經(jīng)纖維瘤病突變譜，將為臨床上方便快捷的篩查和診斷I 型神經(jīng)纖維瘤病患者提供重要的靶點(diǎn)及理論依據(jù)，這一直是本領(lǐng)域研究人員孜孜不倦的探 究領(lǐng)域。

由于NF1基因包含58個(gè)組成性外顯子和3個(gè)可變剪接外顯子，傳統(tǒng)的針對(duì)每一個(gè)外顯子的測(cè)序分析方法耗時(shí)長(zhǎng)，每個(gè)測(cè)序樣本完成檢測(cè)一般需六、七天。而其他檢測(cè)方法如NGS、FISH或MLPA等，需配備價(jià)格昂貴的大型儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)條件要求高，導(dǎo)致檢測(cè) 成本大大升高。

另外，NF1基因的突變類(lèi)型除點(diǎn)突變外，還存在大片斷缺失、一個(gè)或多個(gè)外顯子的重 復(fù)/缺失等多種類(lèi)型。通過(guò)單一方法檢測(cè)NF1基因突變易漏檢，這也是目前NF1致病基因突變檢測(cè)困擾臨床遺傳診斷人員的一個(gè)難題。

綜上所述，尋找對(duì)診斷有效的新致病突變，并研制省時(shí)、精準(zhǔn)、且實(shí)驗(yàn)條件要求較低 的診斷試劑對(duì)NF1基因突變?nèi)鏅z測(cè)，是解決I型神經(jīng)纖維瘤病診斷難題的根本方法。