[發明專利]一種I型神經纖維瘤病致病突變基因及基于此突變基因的病因學診斷試劑

有效

• 申請號: 201611189175.7
• 申請日: 2016-12-21
• 公開（公告）號: CN106755399B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 俞萍
• 申請（專利權）人: 杭州艾諾醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 11282 北京中海智圣知識產權代理有限公司
• 代理人: 胡靜<國際申請>=<國際公布>=<進入國

1.一種基于I型神經纖維瘤病致病基因突變的病因學診斷試劑，其特征在于，所述突變位于NF1基因第48號外顯子區域，其編碼第7106位的鳥嘌呤替換為腺嘌呤從而引起第2369位的色氨酸突變為終止密碼子(c.7106G>A，p.W2369X)；所述診斷試劑包括點突變分析試劑盒，所述試劑盒包括1)總RNA提取體系試劑盒：被測個體外周靜脈血總RNA提取；2)RNA反轉錄及cDNA擴增體系試劑盒；3)cDNA測序體系試劑盒；所述cDNA測序體系試劑盒：對反轉錄獲得的cDNA以SEQ ID NO.7-16所示五個引物對進行PCR擴增，再對擴增得到的cDNA五個大片段以SEQ ID NO.17-60所示引物對同時進行巢式PCR擴增和測序，并與原NF1基因編碼DNA序列比對，當擴增產物中c.7106G>A，p.W2369X突變存在時為I型神經纖維瘤病患者。

2.按照權利要求1所述的病因學診斷試劑，其特征在于，所述診斷試劑還包括NF1基因外顯子缺失分析試劑盒：以所述反轉錄獲得的NF1基因cDNA為模板，以SEQ ID NO.61-70所示引物對分別對NF1的外顯子3、11、25、34、58進行實時熒光定量PCR擴增，以2^-ΔΔCt法進行數據分析，計算得到五個外顯子的相對基因含量，當五個外顯子的相對基因含量均在0.5左右時為外顯子缺失攜帶者。

3.按照權利要求2所述病因學診斷試劑，其特征在于，所述診斷試劑還包括NF1全基因大片段缺失分析試劑盒，所述試劑盒包括1)DNA提取體系試劑盒：被測個體外周靜脈血基因組DNA提取；2)基因內微衛星多態標志分析試劑盒：以所述基因組DNA為模板，以SEQ IDNO.1-6所示的三對引物對27AC28.4、27CAGT、38TG53.0三個多態性位點進行PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物，當PCR產物中三個引物對擴增的片段均為純合子時NFI基因存在全基因大片段缺失的可能性。

4.按照權利要求1所述的病因學診斷試劑，其特征在于，所述對cDNA進行PCR擴增獲得五個大片段時，引物退火溫度為60℃；對五個大片段進行巢式PCR擴增時，引物退火溫度為62℃。

5.按照權利要求2所述的病因學診斷試劑，其特征在于，所述實時熒光定量PCR擴增合成引物片段不超過350bp。

6.按照權利要求3所述的病因學診斷試劑，其特征在于，所述27CAGT擴增片段的大小為201bp左右，27AC28.4擴增片段的大小為214bp左右，38TG53.0擴增片段的大小為479bp左右。

7.按照權利要求3所述病因學診斷試劑中用于檢測NF1基因突變的引物對組，其特征在于，包括用于檢測NF1基因大片段缺失的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6所示；用于擴增cDNA獲得五個大片段的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示；用于對cDNA的五個大片段進行巢式PCR擴增的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17-60所示；用于檢測NF1基因外顯子缺失的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.61-70所示。

8.按照權利要求1、2或3所述病因學診斷試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將所述引物對組中的70條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內：PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。