[發明專利]靶向EGFRvIII干擾PD-1降低腫瘤免疫逃逸的CAR-T載體及構建方法和應用

在審

• 申請號: 201611188014.6
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN108203718A
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 吳小江;王聰;顧莉萍
• 申請（專利權）人: 上海生博生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/867;A61K48/00;A61K39/395;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海宏京知識產權代理事務所(普通合伙) 31297
• 代理人: 王函

本發明公開了一種靶向EGFRvIII干擾PD?1降低腫瘤免疫逃逸的CAR?T載體，包括：用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子，如SEQ ID NO.1所示；3′UTR中的PD?1shRNA，所述PD?1shRNA的序列如SEQ ID NO.25所示；基因傳遞載體；以及用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL和EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH。此外，本發明還公開了該載體的構建方法及其在制備干擾PD?1降低腫瘤免疫逃逸的藥物中的應用。本發明所采用的針對EGFRvIII的CAR?T技術，并通過干擾T淋巴細胞內PD?1的表達，抑制腫瘤細胞免疫逃逸的發生，增強T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷，從而提高CAR?T免疫療法抗腦膠質瘤效果。

技術領域

本發明屬于醫學生物領域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種靶向EGFRvIII干擾PD-1降低腫瘤免疫逃逸的CAR-T載體。此外，本發明還涉及該載體的構建方法和應用。

背景技術

隨著腫瘤免疫學理論和技術的發展，免疫細胞治療在腫瘤治療中的作用日益受到重視。研究發現，T淋巴細胞是腫瘤細胞的天敵，在腫瘤免疫應答中起主要作用，對腫瘤細胞有極強的殺傷作用。

嵌合抗原受體T細胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T免疫療法)是最近幾年來迅速發展起來的一種新型細胞免疫治療技術[Eleanor J.Cheadle，et al.CAR T cells:driving the road from the laboratoryto the clinic.Immunological Reviews 2014.Vol.257:91–106]。它是基于免疫系統識別與活化理論，通過基因工程技術，將靶向特異識別(單鏈抗體scFv)、啟動免疫活性和攻擊腫瘤細胞的元件整合成一個基因，并將其轉導入患者自身T淋巴細胞中，并輸回患者體內，使患者重新獲得特異性識別腫瘤細胞，激活自身T細胞，有針對性地攻擊并殺傷所識別的腫瘤細胞的能力。這是一個革命性和顛覆性的腫瘤治療技術，在臨床上已經顯示其強大的對B淋巴性白血病的腫瘤治療效果，能達到80％治愈B淋巴性白血病的效果。《科學》雜志將過繼性靶向腫瘤免疫治療列為2013年十大科學突破的首位。

CAR-T免疫療法中最核心的理論基礎是T淋巴細胞的識別與活化，它主要是通過不同的scFv識別腫瘤細胞上不同的特異性抗原，再通過CD8分子的Hinge和Transmembrane區將信號傳至T淋巴細胞膜內的CD28或CD137和TCR共刺激激活區，從而達到激活自身T淋巴細胞，有針對性地攻擊并殺傷所識別的腫瘤細胞的目的。但不同研究者們用不同的靶點和共刺激信號組合開展的研究所得到結果存在一定的差異性，不同的研究者用不同的腫瘤在體內和體外的研究中得到的結果不盡相同[Wilkie S，Picco G，Foster J，etal.Retargeting of human T cells to tumorassociated MΜC1:the evolution of achimeric antigen receptor.J Immunol2008；180:4901–4909.]。所以CAR-T免疫療法之間的差異可能不止來自于信號傳導激活、scFv胞外的抗原結合、重組T淋巴細胞的培養擴增，可能也和機體內腫瘤細胞對嵌合抗原受體T細胞適應性改變(如腫瘤細胞的免疫逃逸等)或復雜的腫瘤微環境相關，從而影響了CAR-T細胞的最終抗腫瘤效果。