[發明專利]靶向EGFRvIII干擾PD-1降低腫瘤免疫逃逸的CAR-T載體及構建方法和應用

在審

• 申請號: 201611188014.6
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN108203718A
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 吳小江;王聰;顧莉萍
• 申請（專利權）人: 上海生博生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/867;A61K48/00;A61K39/395;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海宏京知識產權代理事務所(普通合伙) 31297
• 代理人: 王函

1.一種靶向EGFRvIII干擾PD-1降低腫瘤免疫逃逸的CAR-T載體，其特征在于，包括：

用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子，如SEQ ID NO.1所示；

3′UTR中的PD-1shRNA，所述PD-1shRNA的序列如SEQ ID NO.25所示；

基因傳遞載體；

以及用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL和EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH。

2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，

所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ IDNO.2所示的CD8 leader嵌合受體信號肽、如SEQ ID NO.3所示的EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO.4所示的單鏈抗體鉸鏈Linker、如SEQ ID NO.5所示的EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO.6所示的CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.7所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、如SEQ ID NO.8所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO.9所示的TCR嵌合受體T細胞激活域；

所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ IDNO.2所示的CD8 leader嵌合受體信號肽、如SEQ ID NO.3所示的EGFRvIII單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO.4所示的單鏈抗體鉸鏈Linker、如SEQ ID NO.5所示的EGFRvIII單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO.6所示的CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.7所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、如SEQ ID NO.8所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQID NO.9所示的TCR嵌合受體T細胞激活域、以及如SEQ ID NO.24所示的CD28嵌合受體共刺激因子。

3.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述基因傳遞載體包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體。

4.如權利要求3所述的載體，其特征在于，所述基因傳遞載體為第三代慢病毒載體，該第三代慢病毒載體包括含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列、原核復制子pUC Ori序列、病毒復制子SV40 Ori序列、RSV啟動子、慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件。

5.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述3′UTR中的PD-1shRNA，在3′UTR中增加mir-30臂，形成如SEQ ID NO.10所示PD-1shRNA序列。

6.一種如權利要求1-5任一項所述的靶向EGFRvIII干擾PD-1降低腫瘤免疫逃逸的CAR-T載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提供基因傳遞載體；

(2)將如SEQ ID NO.1所示的人EF1α啟動子、3′UTR中加PD-1shRNA，用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設計方案，經過酶切、連接、重組反應克隆至基因傳遞載體中，得到二代CAR或三代CAR設計的基因傳遞載體；

(3)包裝基因傳遞載體；

(4)純化載體，得到重組CAR-T載體。