[發明專利]肺癌多基因變異文庫構建方法

有效

• 申請號: 201611187870.X
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106757379B
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 趙新泰;王明;趙會
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

本發明涉及一種肺癌多基因變異文庫構建方法，包括以下步驟：A.根據肺癌相關基因的變異區域，設計能夠檢測這些變異區域的引物對；B.計算得到各引物對的判斷參數R，將判斷參數R的值小于或等于1的引物對，歸為第一組引物組合液，將判斷參數R的值大于1的引物對，歸為第二組引物組合液；C.將待測樣品DNA抽提純化；D.分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進行初始PCR擴增；E.對所述目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液進行文庫PCR擴增，得到測序文庫。本發明的肺癌多基因變異文庫構建方法所構建的文庫測序通量高，靈敏度強，特異性強，能夠用于檢測游離DNA低頻突變的。

技術領域

本發明涉及一種肺癌多基因變異文庫構建方法，屬于生物技術領域。

背景技術

目前腫瘤的發病率和死亡率高于其他疾病，開發以非侵入式診斷策略進行腫瘤基因診斷研發，針對腫瘤靶標與化療用藥后復發、轉移與抗藥性，而傳統疾病診斷通過臨床經驗、病理監測、細胞檢測作為依據，有靈敏度的限制，也無法做到早期發現早期治療或提早預測提早預防。

新一代高通量基因檢測技術，當今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion Torrent^TM系列測序儀為代表，有著其他技術不可比擬的高通量、低成本等優勢。已被廣泛用于各類生物學研究核醫學檢測。對有參考的物種序列，進行全基因組重測序，在全基因組水平上檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。新一代測序技術通過全基因組測序構建了大量常規物種的基因組圖譜，也促進了測序技術的告訴發展。同時，高通量測序技術在基因診斷和基因治療方面也有著重要的作用，某些疾病的易感基因通常只占基因組很小的一部分，對這些易感基因的研究并不需要對全基因組測序，而只需要對特定的幾個基因進行研究，目標序列捕獲測序的出現，使得對基因組塔頂區域的研究成為可能。這項技術首先合成大量能與基因組特定區域互補結合的寡核苷酸序列，通過PCR擴增富集目標區段，然后用高通量測序技術對這些區段進行測序。

SNPs(單核苷酸多態性)指在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數核苷酸序列一直，而只有一個堿基不同的現象。SNP是人類DNA中常見的變異形式，數以百萬存在整個人類的基因組中，部分SNP能夠導致蛋白質氨基酸編碼改變或基因表達調控改變。拷貝數變異(CNV，Copy number variations)指在人類基因組中廣泛存在的，從1Kbp到數百萬bp范圍內的缺失、插入、重復和復雜多位點的變異。SNPs和CNVs是人類表型變異的兩個重要潛在來源，都是與基因組參考序列比對，與基因表達形狀各有不同程度的顯著相關。對SNPs的關聯研究目前較多，許多CNVs位于基因結構變異的復雜區域，一些CNVs與鄰近的SNPs存在連鎖不平衡，可通過檢驗SNPs基因型推測鄰近的CNVs。理想的是每個樣本DNA能用一個整合的分析同時檢測SNPs和CNVs，擴增子測序能根據研究者目的，針對目標區域進行高覆蓋度的測序，還可以檢測到低頻突變。采用擴增子測序，研究者可以對基因組中感興趣的關鍵區域進行重點研究。

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，肺癌的發病率在多數國家呈明顯上升趨勢,且逐年不斷增高,是世界各地最常見癌的一種,其發病率及死亡率占各種惡性腫瘤的首位。因此研究和發現與肺癌發生、發展相關的因子對于肺癌的早期發現、早期診斷及治療方案的擬定和預后的判斷具有重要的意義。

目前，對于肺癌基因檢測的診斷方法多數停留在單個基因或者幾個位點的檢測水平，檢測方法多為熒光PCR、芯片法等，但這種方法存在不同的缺陷，如操作復雜，引物或探針設計復雜、結果不易判讀、重復性差、假陽性和假陰性多，檢測靈敏度低、聯合基因數目較少、通量低等，不能滿足臨床多樣本多位點篩查、診斷和檢測的實際需求，從而使腫瘤患者錯失了最佳的治療時期。而且多重PCR擴增效率的一致性一直是大難題。擴增子越多，不均一性越高。這使用大于500Kb的范圍的測序，很難用擴增子測序的方法做好。