[發明專利]肺癌多基因變異文庫構建方法

有效

• 申請號: 201611187870.X
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106757379B
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 趙新泰;王明;趙會
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

1.一種肺癌多基因變異文庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.根據肺癌相關基因的變異區域，設計能夠檢測這些變異區域的引物對，所述引物對的5’端均引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基；

B.通過引物設計軟件得到各引物對的參數W1、Tm1、W2和Tm2，從而計算得到各引物對的判斷參數R，計算公式如下：

R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；

其中，W1是擴增產物的GC含量，Tm1是擴增產物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值，

將判斷參數R的值小于或等于1的引物對，歸為第一組引物組合液，將判斷參數R的值大于1的引物對，歸為第二組引物組合液；

C.將待測樣品DNA抽提純化；

D.分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進行初始PCR擴增得到目標片段，然后清除引物，采用第一組引物組合液進行初始PCR擴增時的退火溫度低于采用第二組引物組合液進行初始PCR擴增時的退火溫度；

E.對所述目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后進行純化；

F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對純化后的帶接頭片段進行文庫PCR擴增，然后進行純化，得到測序文庫。

2.根據權利要求1所述的肺癌多基因變異文庫構建方法，其特征在于：所述肺癌相關基因包括AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、 FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11，TSC1、TSC2，EGFR、TP53、PTEN、FGFR1中的一種或多種；其中AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、 C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11，TSC1、TSC2的變異測序類型是突變測序，EGFR、TP53、PTEN的變異測序類型是外顯子測序；C-met、HER2、FGFR1、PIK3CA的變異測序類型是擴增測序。