[發明專利]一種能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母

有效

• 申請號: 201611186552.1
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106854657B
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 張宏剛;李莉
• 申請（專利權）人: 廣州格拉姆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;舒勝英

本發明公開了一種能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母，該重組釀酒酵母中含有輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體，該載體中含有特定的蛋白酶基因和抗菌肽基因。本發明基因重組釀酒酵母能夠實現蛋白酶降解，增加氮源或生產功能性小肽，同時分泌的抗菌肽具有抑制雜菌，促進機體生長和增強免疫等多種作用。此外，將不同特性的蛋白酶基因間的組合搭配，發揮不同蛋白酶對蛋白質降解的協同作用，其中重組釀酒酵母能夠實現分泌不同pH范圍的蛋白酶類，并不對抗菌肽基因進行降解，從而同步實現蛋白的降解和抗菌肽分泌等。

技術領域

本發明涉及基因工程和發酵工程等領域，更具體地，涉及一種能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的重組釀酒酵母。

背景技術

飼料原料中蛋白質成分一般比較豐富，一般需要通過蛋白酶類降解成肽類、氨基酸，進行再利用；許多益生菌類，例如芽孢桿菌以及黑曲霉或米曲霉等都會分泌蛋白酶，對環境中蛋白質成分進行分解利用，從而促進益生菌自身的菌體生長，但是釀酒酵母或乳酸菌分泌的蛋白酶類較少，對蛋白質物料降解能力較低，一般需要補充蛋白胨等蛋白質降解代謝物才能較好的生長；飼料中也一般采用酸性或中性蛋白酶。蛋白酶按照其作用方式，分為內切酶和外切酶，一般的微生物蛋白酶類通常分為內切酶和外切酶的混合物。飼用動物大多需要補充蛋白酶類，例如早期斷奶仔豬常需要添加蛋白酶類，彌補體內分泌消化酶的不足。

抗菌肽(antimicrobial peptide)原指昆蟲體內經誘導而產生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質，分子量在2000～7000左右，由20～60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數具有強堿性、熱穩定性以及廣譜抗菌等特點。抗菌肽抑制致病菌生長，不同抗菌肽對細菌、真菌、原蟲以及病毒等具有不同殺傷能力；抗菌肽還具有選擇性免疫激活和調節功能。

釀酒酵母作為益生菌的重要組成部分。在釀酒酵母表達系統實現蛋白質降解酶類和抗菌肽的分泌表達，能夠將兩者的優點進行有機搭配：一方面分泌出來蛋白酶可以降解培養基中的蛋白質，增加氮源、促進目的益生菌生長；另一方面可以分泌抗菌肽，抑制雜菌。此外，表達的蛋白酶基因中，發揮了不同最適pH下的蛋白酶或不同酶切位點的蛋白酶之間的協同作用，因而能夠更有效地對蛋白質原料進行降解，生產具有功能性的小肽或氨基酸等。在應用方面，利用酵母培養物飼養動物，能補充消化酶、增強免疫并促進生長；在餐廚廢棄物中，降解廢棄蛋白質、增加氮源、抑制雜菌。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，為了克服現有技術的上述不足，提供一種能夠在飼料添加、工業酒精生產、餐廚廢棄物等能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽重組釀酒酵母。本發明是通過將酸性蛋白酶(Acid protease)基因、中性蛋白酶(Neutral protease)基因、天冬氨酸蛋白酶(Aspartic-type Endopeptidase)基因、絲氨酸蛋白酶(Serine Protease)基因不同的搭配和優化，結合抗菌肽基因通過釀酒酵母共表達載體轉入到釀酒酵母中。不同的蛋白酶基因基因間的不同搭配，可實現蛋白酶間的合理優化，有效發揮蛋白酶間的協同作用，同時分泌有抗菌活性的抗菌肽類，從而得到具有多功能益生重組釀酒酵母。

本發明的目的在于提供一種能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體及其構建方法。

本發明的另一目的在于提供一種能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的益生重組釀酒酵母及其構建方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種能輔助降解蛋白質并分泌抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體，該載體中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因；

所述抗菌肽基因的堿基序列如SEQ ID NO：5所示；

所述蛋白酶基因選自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、絲氨酸蛋白酶基因中的至少一種。