[發明專利]肉制品中動物源性成分的鑒定方法及鑒定試劑盒

有效

• 申請號: 201611185286.0
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN108220450B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 吳昊;謝文佳;王艷麗;郭良起
• 申請（專利權）人: 河南廣電計量檢測有限公司;廣州廣電計量檢測股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 鄭彤

1.一種肉制品中動物源性成分的鑒定方法，其特征在于，采用實時熒光重組酶聚合酶擴增技術，所述鑒定方法包括如下步驟：

S1、制備待測樣品；

S2、從所述待測樣品中提取總DNA；

S3、引物、探針的設計篩選：根據目標動物的基因組DNA序列設計引物和探針；

S4、擴增試劑準備：將步驟S3設計的引物和探針與緩沖溶液、模板DNA、無菌雙蒸水混合，得到混合液，再與凍干重組酶聚合酶混合均勻，其中，所述模板DNA包括：陽性對照組、陰性對照組和空白對照組，陽性對照組用目標動物的基因組DNA作為模板DNA，陰性對照組用其他動物的基因組DNA作為模板DNA，空白對照組用去離子水替代基因組DNA作為模板DNA；

S5、實時熒光重組酶聚合酶擴增：進行實時熒光重組酶聚合酶擴增反應，獲取陽性對照組、陰性對照組和空白對照組的實時熒光強度曲線，驗證所述熒光重組酶聚合酶擴增技術的有效性；

S6、結果鑒定：將待測樣品的總DNA、陽性對照組的模板DNA在相同條件下進行實時熒光重組酶聚合酶擴增反應，得到結果；

所述目標動物為豬；所述目標動物的基因組DNA序列是豬細胞色素b的基因序列；

所述引物的序列為：上游引物：SEQ ID NO.1，下游引物：SEQ ID NO.2；

所述探針的序列為：SEQ ID NO.3。

2.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述混合液包括：

上游引物：200～600nM；

下游引物：200～600nM；

探針：50～150nM。

3.根據權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述混合液為：

上游引物：10μM 2.1μL；

下游引物：10μM 2.1μL；

探針：10μM 0.6μL；

緩沖溶液 29.5μL；

模板DNA 1.0μL；

無菌雙蒸水 11.1μL。

4.根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述實時熒光重組酶聚合酶擴增為：加入醋酸鎂溶液至反應離心管中使其終濃度為12-21mM，啟動反應，反應條件為：反應時間：10min～25min；反應溫度：37～40℃之間恒溫。

5.根據權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于，所述實時熒光重組酶聚合酶擴增為：加入3.6μL濃度為280mM的醋酸鎂溶液至反應離心管中，啟動反應，反應條件為：反應時間：15min；反應溫度：37～40℃之間恒溫。

6.根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述擴增試劑準備為：所述混合液在離心管中混合均勻，用微量移液槍將反應體系轉移至裝有凍干重組酶聚合酶的微量離心管，溶解混合均勻。

7.根據權利要求1～6任一所述的鑒定方法，其特征在于，所述制備待測樣品為：用組織搗碎機將所述待測樣品均質成粉狀或糜狀，或者將所述待測樣品切成小塊在液氮冷凍的情況下研磨至粉狀。

8.根據權利要求7所述的鑒定方法，其特征在于，所述制備待測樣品為：所述待測樣品為干燥固體，用組織搗碎機將待測樣品均質成粉狀或糜狀。

9.根據權利要求7所述的鑒定方法，其特征在于，所述制備待測樣品為：所述待測樣品為濕狀，將所述待測樣品切成小塊在液氮冷凍的情況下研磨至粉狀。

10.一種肉制品中動物源性成分的鑒定試劑盒，包括引物和探針，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探針的序列如SEQ ID NO.3所示。