[發明專利]一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用

在審

• 申請號: 201611182570.2
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN106729694A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 唐榮宏;李亞杰;楊保收;付旭彬;梁武
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司
• 主分類號: A61K39/235
• 分類號: A61K39/235;A61P1/16;A61P31/20;C12N15/85
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙)12219
• 代理人: 陳松

技術領域

本發明涉及生物制品技術領域，進步涉及DNA疫苗研發技術，具體涉及一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用。

背景技術

Ⅰ群禽腺病毒組成了腺病毒科的禽腺病毒屬。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感。可以通過水平和垂直兩種途徑傳播。雖然感染雞的12個血清型之間及血清型內部的毒力各有不同，但12個血清型均能誘發包涵體肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)的主要臨床癥狀為產蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現多發性局灶性壞死，肝細胞中見核內包涵體。FAV-4具有明顯的致病年齡段，對雛雞的致病力最強，可通過接觸水平傳播及垂直傳播。1987年在巴基斯坦臨近卡拉奇的安哥拉首先報道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的幾個邦、厄瓜多爾、秘魯、智利、中南美洲、俄羅斯和孟加拉國等國相繼發現該病。如今，世界各地都有HHS的蹤影，遍及拉丁美洲、中東和亞洲的一些國家。

通過對Ⅰ群禽腺病毒的流行病學調查，該病在我國雞群中發病率較高，且呈逐年上升趨勢。發病的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發病。特別是2010年以后發病呈現增加趨勢，在全國范圍內均有流行。臨床表現包涵體肝炎(IBH)、心包積水肝炎綜合征(HHS)。隨著我國養雞業的迅速發展，Ⅰ群禽腺病毒的發病率給飼養業造成了嚴重的經濟損失。關于該病的防治，國外已有預防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今國內尚無疫苗可用，導致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。

目前，FAV-4接種雞胚或原代雞腎臟細胞肝細胞來接種制備疫苗。雞胚繁殖病毒毒價低，病毒需要高倍濃縮，成本高昂；而原代肝腎細胞制備繁瑣、易污染、不易轉染，且在制備細胞過程中易混入雞胚成纖維細胞(CEF)，不利于實驗操作。所以急需新型的疫苗。DNA疫苗的出現，開拓了FAV疫苗研究的新方法。DNA疫苗能同時誘導體液免疫和細胞免疫，對不同血清亞型毒株具有交叉保護，還具有嵌合免疫、多重免疫及聯合免疫等優點。

Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形態，毒粒直徑為70-90nm，無囊膜，呈球形，二十面體對稱結構。病毒粒子具有252個殼粒，240個非頂角殼粒為六鄰體，12個頂角殼粒為五鄰體，每個五鄰體有2條纖維突起。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其應用，以解決現有技術的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗對Ⅰ群4型禽腺病毒免疫效果不佳的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中抗原物質的免疫原性較低。

本發明要解決的再一技術問題是現有技術中Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗對疾病的防疫范圍較為局限。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，該疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因。

作為優選，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因是在其天然表達基因基礎上以雞偏嗜密碼子替換其中的雞稀有密碼子所得的產物。

作為優選，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的表達基因是序列如SEQ ID No.2所示的DNA。

作為優選，所述抗原是通過以下方法制備的：

1)分別以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段為引物，以FAV-4病毒為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環進行PCR擴增；將PCR產物直接克隆到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-FAV4C；

2)將FAV-4-C基因的核苷酸序列優化至SEQ ID No.2所示狀態，合成該基因到pMD-18T載體上，即得到重組載體pMD-18T-optiFAV4C；

3)將重組載體pMD-18T-optiFAV4C與pCAGGS用EcoR I和Sma I雙酶切，酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pCAGGS，然后16℃連接過夜，將連接產物在宿主細胞中擴增。

作為優選，所述將連接產物在宿主細胞中擴增，具體包括以下操作：將連接產物轉化到E.coli DH5α感受態細胞，挑取單菌落接種到2ml含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基，37℃振蕩培養12h，提取質粒后用雙酶切進行鑒定，即得到作為抗原的質粒pCAGoptiFAV4C。