[發明專利]B30位蘇氨酸缺失人胰島素晶體的制備方法

有效

• 申請號: 201611179991.X
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN106749616B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 劉海峰;聶洪霞;應歡;周祥山;解福生;黃菁;李志;龐甲佩;史兆松
• 申請（專利權）人: 華潤昂德生物藥業有限公司;華東理工大學
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/30
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 霍雪梅;余光軍

本發明公開了一種B30位蘇氨酸缺失人胰島素晶體的制備方法，屬于重組人胰島素及其類似物晶體的制備領域。本發明B30位蘇氨酸缺失人胰島素晶體的制備方法，包括以下步驟：(1)將B30位蘇氨酸缺失人胰島素溶解，加入有機溶劑、檸檬酸三鈉、無機鹽和鋅離子，得到結晶液；(2)調節結晶液的pH值，進行結晶，即得。本發明試驗發現，結晶液中檸檬酸三鈉濃度、鋅離子與B30位蘇氨酸缺失人胰島素的摩爾比以及有機溶劑濃度等對晶體的形態、大小以及收率等具有重要影響。本發明通過對結晶條件進行優化，使制備的B30位蘇氨酸缺失人胰島素晶體形狀規則、大小均一，而且結晶的收率和純度高，利于后續的修飾和純化工藝。

技術領域

本發明涉及胰島素類似物（或人胰島素前體）晶體的制備方法，尤其涉及一種B30位蘇氨酸缺失人胰島素（desB30）晶體的制備方法，屬于重組人胰島素及其類似物晶體的制備領域。

背景技術

近年來隨著人們生活水平的提升，糖尿病患者數量也持續增加。胰島素制品是公認的最有效的糖尿病治療手段之一。隨著科學技術的發展，從提取動物胰島素到有機合成胰島素、半合成人胰島素，到現如今占主要市場的重組人胰島素，胰島素的工業化生產過程已經歷了翻天覆地的變化。

去除B30位蘇氨酸的胰島素（desB30）是通過重組微生物發酵得到胰島素前體經純化、酶切后得到的重要中間體，后續通過不同的修飾反應和純化后可制備得到地特胰島素、德谷胰島素或其它胰島素類似物。

地特胰島素是一種中性、可溶的長效胰島素，它是原型胰島素去除了B鏈第30為蘇氨酸，通過酰化作用在B29位賴氨酸側鏈氨基結合一個14碳的直鏈脂肪酸而成，具有藥效長并可減少低血糖的出現等優點。

德谷胰島素是新一代可溶性、超長效基礎胰島素類似物，其分子保留了絕大部分的人胰島素氨基酸序列，僅是去掉人胰島素B鏈30位的蘇氨酸，并通過谷氨酸連接子將一個十六碳脂肪二酸側鏈連接到B29位賴氨酸上，具有藥效長，低血糖發生率低的特點。

雖然desB30樣品經過胰島素前體發酵液微孔過濾、初級純化、酶切和等電點沉淀，但由于發酵產物的成分相對復雜，酶切得到的desB30純度約在80%左右，還是有很多可見和不可見的色素或其它蛋白或核酸等，影響后續工藝的開發，同時易造成對純化介質的污染，影響其使用次數。除此之外，直接等電點沉淀的desB30還存在不穩定、易降解或脫氨等缺點，因此需要增加一步工藝去除這些雜質，提高澄清度和純度以及儲存穩定性。

通過對desB30樣品進行結晶工藝研究，獲得晶型相對均一的晶體，desB30以固態晶體形式存在，樣品更穩定，更易貯存。另外desB30晶體的純度高，有利于后續修飾反應的開展。因此，進行desB30的結晶工藝研究具有重要意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種B30位蘇氨酸缺失人胰島素（desB30）晶體的制備方法，該方法操作簡單，結晶的收率高，所制備的desB30晶體形狀規則、大小均一，而且純度高。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

本發明首先公開了一種B30位蘇氨酸缺失人胰島素晶體的制備方法，包括以下步驟：（1）將B30位蘇氨酸缺失人胰島素溶解，加入有機溶劑、鋅離子、檸檬酸三鈉和無機鹽，得到結晶液；（2）調節結晶液的pH值，進行結晶，即得。

其中，步驟（1）所述結晶液中檸檬酸三鈉的濃度為0.01-0.1 M，優選為0.01-0.05M，更優選為0.025-0.05 M，最優選為0.04-0.05 M。

步驟（1）所述結晶液中鋅離子與B30位蘇氨酸缺失人胰島素的摩爾比為7-20：1，優選為10-15：1，更優選為10-12：1，最優選為10-11：1。所述鋅離子來自于常見的鋅源，優選的，所述鋅離子來自于氯化鋅、醋酸鋅或碘化鋅中的任意一種，優選為氯化鋅或醋酸鋅中的任意一種。