[發明專利]檢測孔雀石綠的適配體電化學生物傳感器及其制備方法

有效

• 申請號: 201611175306.6
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106706748B
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 陳旭;朱萬軍;吳立冬;付嘯辰;楊文勝
• 申請（專利權）人: 北京化工大學;中國水產科學研究院
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48;G01N27/327
• 代理公司: 北京華誼知識產權代理有限公司 11207
• 代理人: 王普玉

一種檢測孔雀石綠的適配體電化學生物傳感器及其制備方法，屬于生物傳感器技術領域。識別元件是單鏈DNA適配體，含有38個堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質亞甲基藍作為信標分子。適配體通過Au?S鍵固定在金電極表面，亞甲基藍作為電化學響應信號，孔雀石綠與適配體相互作用改變適配體的空間構型，使電化學信號升高，從而實現對孔雀石綠的快速檢測。優點在于，適配體價格經濟、易于標記，傳感器的制備程序和檢測方法簡單，可應用于水體中現場準確、快速和高靈敏地檢測孔雀石綠。

技術領域

本發明屬于生物傳感器技術領域，特別涉及一種檢測孔雀石綠的適配體電化學生物傳感器及其制備方法。可以用于漁業生產中孔雀石綠的檢測。

背景技術

孔雀石綠(Malachite green,簡稱MG)，屬三苯甲烷類染料，其代謝為無色孔雀石綠，長期以來，由于孔雀石綠在水產養殖中具有良好的抗真菌病，水產品保鮮以及價格低廉等優點，因此，成為許多養殖戶青睞的“漁藥”來使用，但這兩種物質均具有高毒素、高殘留和高致畸、致突變等副作用，已成為重大的食品安全隱患。目前，孔雀石綠被我國列為禁用漁藥，現有的測定方法主要有高效液相色譜法、氣質聯用法、液質聯用法等。這些方法有操作繁瑣、儀器價格昂貴，需要專業的技術人員，而且不適合現場大規模的檢測等缺點。而現場常使用商品化酶聯免疫試劑盒法檢測孔雀石綠，但容易產生假陽性結果。因此，我國急需建立一種準確、快速、便攜、簡單操作的檢測孔雀石綠的方法

近年來，適配體(aptamer)作為識別元件特異性識別小分子的生物傳感器成為研究熱點，主要是其識別元件較穩定，受環境干擾和限制比較少，易于合成等方面的優勢。目前，已有兩個專利公開了兩種適配體型檢測孔雀石綠的方法。其中，公開專利(申請號為200710070381.0)一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法，利用特定序列的單鏈DNA為適配體，采用酶聯顯色法檢測，但其酶聯法易產生結果假陽性的問題沒有解決。另一個，公開專利(申請號為201410008020.3)一種通過電化學適配體傳感器來檢測孔雀石綠的方法，采用特定序列RNA為識別元件，通過適配體和目標物的結合作用把目標物結合到電極表面，然后在結合上目標物的抗體，構成夾心結構；電化學方法避免了一定程度在檢測中的假陽性問題，但是該專利中抗體制備需要動物性實驗時間長，也比較困難；更主要的RNA適配體價格昂貴、不穩定而且標記相當困難，這也限制了RNA適配體在檢測孔雀石綠方面的廣泛應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測孔雀石綠的適配體電化學生物傳感器及其制備方法，解決了檢測結果易出現假陽性的問題，并大幅降低了成本。針對現有的技術的不足，提供一種快速、簡單、準確、成本低可用于水溶液中孔雀石綠檢測的適配體型電化學生物傳感器及其制備方法。

一種檢測孔雀石綠的適配體電化學生物傳感器，包括識別元件和換能器；識別元件是單鏈DNA適配體，序列為GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38個堿基，5’端修飾‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修飾電活性物質亞甲基藍(MB)作為信標分子；換能器為常用的電化學型換能器，工作電極為修飾有上述孔雀石綠單鏈DNA適配體的金電極，對電極為Pt，參比電極為Ag/AgCl；檢測底液為磷酸鹽緩沖溶液。

其檢測原理是：加入孔雀石綠靶分子之前信標分子MB距離電極表面較遠，電子轉移較慢，MB電化學信號響應較小，加入孔雀石綠后與單鏈DNA適配體相互作用形成莖環，MB與電極表面之間的距離被拉近，其電化學信號增加，通過電化學信號的變化，實現對孔雀石綠的檢測。

圖1給出單鏈DNA適配體和孔雀石綠相互作用的紫外‐可見光譜圖。從圖1中可以看出，在波長范圍為220～320nm區間，單鏈DNA適配體本身在260nm處有一個吸收峰。當加入孔雀石綠靶分子后，該吸收峰降低，說明兩種存在著相互作用。

一種檢測孔雀石綠的適配體電化學生物傳感器的制備方法，具體步驟及參數如下：